细胞基因药物的基因递送有病毒及非病毒两种方式,其中病毒递送更为常用。在病毒递送路径中,腺相关病毒(AAV)和慢病毒(Lentivirus)是常用的两种载体;差别是病毒基因组的存在形式,AAV的基因组一般不整合到染色体中,以游离形式存在于染色体之外,且一般会表达数年之久;而慢病毒的基因组则会整合到染色体达到长期持续表达的目的。此外,其它用于基因药物的病毒载体有单纯疱疹病毒(HSV)、痘苗病毒(Vaccina Virus)、痘病毒(Poxviruses)。生理盐浓度下,M-SAN HQ中盐核酸酶性能优于常用核酸酶。山东M-SAN中盐核酸酶70950
Mayer等(2023)以measles virus(麻疹病毒,MV)为例,评估了四种不同核酸酶(BenzonaseTM、DeneraseTM、M-SAN HQ中盐核酸酶及SAN HQ高盐核酸酶)对于染色质DNA去除的效果。Vero细胞通过微载体贴壁培养来生产麻疹病毒MV,72hr后收获上清液,使用3µm cellulose filter(Sartorius)过滤后分装多份,置于-80℃保存便于后续使用。在解冻后的上清中调节对应盐浓度,并加入50 U/ml核酸酶,37℃孵育2hr进行消化,消化后留样;将消化后上清液过Capto Core 700 (Cytiva)柱子,收集流穿液,之后洗杂、洗脱,并分别留样。通过SDS-PAGE分析发现,相比Benzonase等传统核酸酶,在生理盐条件下M-SAN HQ中盐核酸酶更高效将染色质DNA剪切成更小片段,甚至将核小体DNA剪切更彻底。吉林等渗条件中盐核酸酶70950-202中盐核酸酶具有纯度高(≥99%)、 内毒水平低(<0.25EU/1kU)的特点;
此外,文章作者对每个步骤的样品进行纳米颗粒分析(NTA),结果发现:澄清环节后,M-SAN HQ中盐核酸酶和Benzonase处理组才出现比较明确的LV病毒颗粒峰;TFF处理后,回流液样品的LV病毒颗粒峰更加尖锐,表明病毒颗粒分散度更好、稳定性更高。回流液的NTA结果进一步表明,M-SAN HQ中盐核酸酶处理组只有一个病毒颗粒峰,而Benzonase处理组的回流液中有三个峰。作者推测Benzonase处理组的病毒颗粒还有严重的病毒团聚现象,而呈现多峰现象。
除了获得载体的滴度及产量,生产慢病毒更关心的指标主要是各种污染物的去除。总DNA污染的去除百分比在99.1-99.84%,总蛋白污染物的去除百分比在99.85-99.9%。针对宿主细胞的DNA(HCD)及蛋白(HCP),有报道其去除百分比分别为99.8%和99.4%。因为不仅残存的DNA可能是个问题,而且DNA的大小以及由此引起的可能转移整个有功能的开放阅读框也是问题,因此监管机构对残存DNA污染的分子量上限的要求越来越高。例如,FDA的指南‘生产用于传染病适应症的病毒疫苗的细胞基质和其他生物材料的特性和鉴定’中说明,残留的细胞宿主的DNA片段不能超过一个功能基因的长度,估计在200bp左右。M-SAN HQ中盐核酸酶不含动物源成份,无蛋白酶活性;
大多数研究级别的慢病毒是通过批次浓缩而不是粗制剂之后应用的,浓缩基本上是通过两步离心法产生的。在70000g通过超速离心浓缩后的慢病毒再通过蔗糖缓冲(50000g)纯化,然后溶解在配方缓冲液中。一种改进,特别是纯度方面的改进,基于离心/色谱联用的纯化方法。例如,Kutner等评估了组合纯化/浓缩方法。蔗糖缓冲的超速离心结合阴离子交换层析获得了88.2%的收率,而相反的组合则获得了77.6%的收率。在两种方法中,浓缩都超过了100倍,病毒滴度都超过了1010TU/ml(VSV-g包被的慢病毒)。M-SAN HQ ELISA kit检测产品灵敏度高,定量范围为0.12-7.5ng/ml。福建M-SAN HQ中盐核酸酶
致力于从深海microbe中识别新的冷适应酶,用于分子研究、IVD和biopharma领域。山东M-SAN中盐核酸酶70950
伦敦大学学院(UCL)的工艺开发团队,在细胞药物Car-T涉及的慢病毒(Lentivirus,LV)生产过程中,比较了Benzonase和M-SAN HQ中盐核酸酶在酶活、酶切时间、各阶段LV的稳定性等方面的表现,发现在生理盐条件下M-SAN HQ中盐核酸酶酶活更高、酶切时间更短,同时用纳米颗粒分析(NTA)技术确认M-SAN HQ组得到的LV病毒颗粒聚集更少、稳定性更高。他们会继续探究HCD是否影响LV的稳定性,及对LV侵染效率和生命周期是否有影响。通过更多研究,我们探究M-SAN HQ中盐核酸酶助力LV生产的关键机制。山东M-SAN中盐核酸酶70950
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