大多数研究级别的慢病毒是通过批次浓缩而不是粗制剂之后应用的,浓缩基本上是通过两步离心法产生的。在70000g通过超速离心浓缩后的慢病毒再通过蔗糖缓冲(50000g)纯化,然后溶解在配方缓冲液中。一种改进,特别是纯度方面的改进,基于离心/色谱联用的纯化方法。例如,Kutner等评估了组合纯化/浓缩方法。蔗糖缓冲的超速离心结合阴离子交换层析获得了88.2%的收率,而相反的组合则获得了77.6%的收率。在两种方法中,浓缩都超过了100倍,病毒滴度都超过了1010TU/ml(VSV-g包被的慢病毒)。M-SAN HQ中盐核酸酶的生产用原辅料是Non-animal和Non-plant来源的。山东培养基条件中盐核酸酶
染色质由组蛋白和DNA组成,——147个碱基对的DNA缠绕在8个组蛋白(由H2A、H2B、H3和H4形成的八聚体)周围,形成基本的染色质单位,即核小体。核小体像珠串一样串连在一起,并被包装成更高阶的染色质结构。DNA带负电荷,富含碱性氨基酸的组蛋白带正电荷,且组蛋白多聚物有很多疏水区段。所有这些特点导致宿主DNA残留(HCD)能吸附很多物质,包括宿主蛋白残留(HCD)、色谱填料、目的病毒颗粒等,因此,HCD的存在增加了工艺流程的复杂度,同时也降低了病毒颗粒的稳定性。山东培养基条件中盐核酸酶ArcticZymes致力于提供高质量产品,中盐核酸酶具有好的批间一致性、稳定可靠的质量。
除了获得载体的滴度及产量,生产慢病毒更关心的指标主要是各种污染物的去除。总DNA污染的去除百分比在99.1-99.84%,总蛋白污染物的去除百分比在99.85-99.9%。针对宿主细胞的DNA(HCD)及蛋白(HCP),有报道其去除百分比分别为99.8%和99.4%。因为不仅残存的DNA可能是个问题,而且DNA的大小以及由此引起的可能转移整个有功能的开放阅读框也是问题,因此监管机构对残存DNA污染的分子量上限的要求越来越高。例如,FDA的指南‘生产用于传染病适应症的病毒疫苗的细胞基质和其他生物材料的特性和鉴定’中说明,残留的细胞宿主的DNA片段不能超过一个功能基因的长度,估计在200bp左右。
ArcticZymes厂家对盐活性核酸酶系列产品(Salt Active Nucleases,SANs)的生产及质控,包括SAN HQ高盐核酸酶和M-SAN HQ中盐核酸酶,在符合ISO13485:2016体系基础上,增加了cGMP质控标准,如microbes、endotoxin、蛋白酶等;同时提供TSE/BSE声明、无动物源(Animal-Origin Free)声明、非转基因声明等文件协助药物申报。此外,ArcticZymes的生产场地接受客户的定期审计,其第三方审计文件已得到国际TOP CDMO及Biotech的认可,并已经成为国际TOP CDMO的供应商。具体文件体系可以跟厂家或对应销售人员联系。中盐核酸酶更适合细胞培养体系,相比全能核酸酶,酶用量减少到1/3-1/2,HCD去除效率更高。
此外,文章作者对每个步骤的样品进行纳米颗粒分析(NTA),结果发现:澄清环节后,M-SAN HQ中盐核酸酶和Benzonase处理组才出现比较明确的LV病毒颗粒峰;TFF处理后,回流液样品的LV病毒颗粒峰更加尖锐,表明病毒颗粒分散度更好、稳定性更高。回流液的NTA结果进一步表明,M-SAN HQ中盐核酸酶处理组只有一个病毒颗粒峰,而Benzonase处理组的回流液中有三个峰。作者推测Benzonase处理组的病毒颗粒还有严重的病毒团聚现象,而呈现多峰现象。ArcticZymes Technologies旨在是研究和开发具有独特特性的酶。河南培养基条件中盐核酸酶
M-SAN HQ中盐核酸酶更适合细胞基因drug(如AAV、LVV、RV及OV等)的生产。山东培养基条件中盐核酸酶
慢病毒大规模纯化的捕获步骤包括:膜过滤澄清,随后切向流过滤/超滤或者体积排阻色谱浓缩。此外,需用核酸酶(benzonase或M-SAN HQ中盐核酸酶)来去除细胞残留的、质粒来源的DNA污染。这两个步骤顺序可以调整,依据项目工艺而定。两种工艺路线各有优缺点:先用核酸酶消化的优点是可去除大的DNA片段,且后续步骤可以去除残留核酸酶;但所用的核酸酶的量也非常大。与此相反,将核酸酶步骤后置的优点是大幅降低核酸酶的量(成本降低);但后面的步骤必须有将核酸酶去除的能力。此外,后期用核酸酶的缺点是核酸污染可能会结合慢病毒颗粒形成沉淀,进而导致慢病毒在纯化中流失,从而影响得率。山东培养基条件中盐核酸酶
病毒载体作为细胞药物生产的关键原材料,直接关系到细胞产品质量。载体质量的控制和工艺稳定性和批间一致性...
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