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近几年，细胞和基因zhiliao（cell & gene therapy，CGT）领域发展迅猛，在多个方向取得了重大突破，以anti-CD19和BCMA为代的多种CAR-T免疫细胞疗法攻克了一部分血液瘤，多种AAV疗法也给一些难以成药的罕见病提供了有效的zhiliao方案。另一方面，基于CRISPR基因编辑技术的众多基因疗法也进展迅速，较早体外基因编辑疗法较快今年年底能够上市（CRISPR Therapeutics CTX001），体内基因编辑疗法取得了不错的临床数据（Intellia Therapeutics NTLA-2001），使用CRISPR技术制造的通用型CAR-T疗法也是免疫细胞疗法发展的一大趋势（Caribou Biosciences CB-010）。内基因编辑技术可能造成的脱靶效应。浙江种子脱靶检测评估

自基因zhiliao出现之日起，安全性问题就随之产生了，并成为阻碍基因zhiliao研发的一大障碍，吴宁博士认为：“基因zhiliao产品的研发和上市，安全性会将是一个非常重要考量。如果一款产品它安全性有问题的话，在市场化道路上就会受到很大影响。尤其是基因zhiliao，目前处于起始阶段，一旦出现不良事件，很有可能对整个行业都会产生致命打击。具体说来，基因zhiliao的安全性问题主要涉及基因插入突变、脱靶、生物分布和持久性、潜伏再jihuo以及潜在免疫原性等。”广州基因编辑脱靶检测企业脱靶检测分析，推荐唯可生物，实验实力强，专业性高，检测效率高，结果准确率高。

Guide-seq原理图，Discover-seq细胞内的脱靶切割一般无法直接捕获，除了Guide-seq这种连接dsODN来间接记录脱靶位点的方法外，研究者们还想出一种蛋白介导的方法Discover-seq。由于DNA双链断裂后细胞会启动DNA修复机制，大量蛋白参与到断裂处的修复，所以研究者就对相关蛋白进行筛选，找到其中MRE11结合DNA的位点与DNA双链断裂的相关性比较好。DISCOVER-seq便是通过MRE11的CHIP-seq（染色质免疫共沉淀）来反映CRISPR的脱靶位点。。。。

TCR修饰免疫细胞的脱靶毒性可通过评估TCR与人体自身抗原肽的交叉识别能力来评估。首先，应采用体外试验测定TCR修饰的免疫细胞与人自身抗原肽-HLA（与递呈靶抗原肽的HLA等位基因相同）复合物的亲和力，并说明抗原肽的选择依据及选择范围。此外，还应研究其他相关或不相关的蛋白中是否含有靶抗原肽序列。如果TCR与人自身抗原肽有交叉反应可能，应确定靶抗原肽的较小识别基序（motif），并采用计算机预测分析评估交叉反应性。如果计算机预测可识别出具有潜在交叉反应性的抗原肽，应在体外测定TCR修饰免疫细胞对表达相应蛋白或递呈相应抗原肽的的细胞的识别能力。如果不能排除交叉反应性，应基于含有潜在交叉反应性抗原肽的蛋白的表达模式以及TCR与潜在交叉反应性抗原肽的亲和力来进行风险评估。为获得TCR与其他等位HLA潜在交叉反应性的信息，应进行充分的HLA交叉反应性筛选。对于TCR修饰的T细胞，还应关注引入TCR链和内源性TCR之间的错配可能性，应描述和说明旨在降低错配可能性的TCR设计策略。脱靶检测方法，推荐唯可生物，实验实力强，专业性高，检测效率高，结果准确率高。

细胞外检测方法：细胞外检测方法较为直接，将基因组提纯后进行CRISPR体外切割实验，再捕获发生脱靶切割的位点即可。1) Digenome-seqDigenome-seq是较早提出的一类细胞外脱靶位点检测方法，提纯的基因组DNA被Cas9/sgRNA切割后，再经过标准的全基因组测序流程获得测序数据，之后需要较为复杂的生物信息学分析才能够获得CRISPR切割位点的信息。总体来讲，这种方法测序成本较高，并且检测灵敏度也有限。2)SITE-seq为了有效检测到低频脱靶位点，一般需要在建库时定向捕获CRISPR切割位点。SITE-seq就是这样一种测序方法，提纯的基因组DNA经过Cas9/sgRNA切割后，在切割位点末端连接带Biotin的接头；再随机打断基因组，在另一端连接第二个接头；经过链霉亲和素磁珠纯化，只有一轮被Cas9切割的DNA才能够被纯化并测序，实现了CRISPR切割位点的富集。该方法虽然提高了脱靶位点的检测灵敏度，但有着较高的实验要求，每次需要投入大量的基因组DNA，并且无法区分提纯基因组DNA时发生的随机断裂和Cas9的切割，导致产出较为明显的背景信号。同时，由于一轮Biotin接头只会接在Cas9切割位点的一侧，导致测序结果里只能看到脱靶位点一侧的序列。基因编辑治疗过程中安全性评价，即脱靶效应的检测。武汉crispr脱靶检测安评

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CRISPR/Cas系统是细菌和古细菌在不断进化的过程中产生的适应性免疫防御机制，它应用CRISPR RNA（crRNA）以碱基互补的形式引导相应的Cas蛋白识别入侵的外源基因组，并对其DNA进行剪切，用以保护自身的基因组免受外源核酸如噬菌体、病毒等的干扰和破坏。经过人为改造后，可在真核细胞中实现高度灵活且特异的基因组编辑，通过设计特异性向导RNA(Single guide RNA, sgRNA)序列与靶序列进行碱基配对，从而引导Cas蛋白结合到靶序列处，行使DNA切割功能，然后利用细胞的非同源性末端连接(Non-homologous end joining, NHEJ)或同源重组(Homologous recombination,HR)修复机制对断裂的DNA进行插入缺失(Indel)、修复(Repair)或替换(Replacement)。由于其相对于锌指核酸酶(ZFNs)和转录jihuo因子样效应物核酸酶(TALENs)技术更易于操作，而且更高效，因而被广运用于对基因组特定位点进行靶向编辑。浙江种子脱靶检测评估