免疫沉淀技术(Immunoprecipitation,简称IP)是一种生物化学方法,它利用特异性抗体对抗原进行亲和纯化。在含有目的抗原的细胞裂解液中加入特定的抗体以及Protein A/G-Beads(预先将Protein A/G固定结合在磁珠上),根据抗原与抗体、Protein A/G与抗体的Fc的特异性,形成“抗原-抗体-Protein A/G-Beads”复合物,清洗离心后去除溶液中未结合的杂蛋白,检测是否存在目的蛋白。
免疫沉淀技术常用于从细胞或组织裂解物中分离用于免疫印迹检测或其他检测技术的蛋白和其他生物分子。它的目标是分离足够用于Western Blot或其他检测方法检测的蛋白质。
免疫沉淀Co-IP抗体的选择?南京RIP免疫沉淀磁珠货期
ChIP(染色质免疫沉淀)实验是一种强大的技术,用于研究蛋白质与DNA之间的相互作用,尤其是在转录调控、DNA修复、复制以及表观遗传学领域。然而,像所有实验技术一样,ChIP实验也有其优点和缺点。
ChIP实验的优点:
1. 体内反应的反映:ChIP提供了一种在体内研究蛋白质与DNA相互作用的方法,能够真实、完整地反映结合在DNA序列上的靶蛋白的调控信息。
2. 全基因组覆盖:ChIP技术可以覆盖整个基因组,提供关于蛋白质-DNA相互作用的视图。
3. 适用于多种蛋白质:ChIP可以用来研究组蛋白修饰、转录因子以及其他DNA结合蛋白。
ChIP实验的缺点:
1. 实验步骤繁琐。
2. 需要大量起始材料:ChIP实验通常需要大量的细胞或组织作为起始材料。
3. 交联的影响:使用交联剂可能会改变蛋白质的结构,从而影响抗体的识别和蛋白质-DNA的相互作用。
4. 染色质碎裂的分辨率:染色质碎裂的效率和分辨率直接影响ChIP的准确性,需要优化以获得结果。
5. 抗体质量:抗体的质量对实验结果至关重要,但高质量、特异性强的抗体可能难以获得或成本较高。
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免疫沉淀纯化所得抗原量低有多种原因,
A. 纯化所得抗原量低
1. 抗原结合水平低
IP 应用中出现低抗原结合水平的可能原因有很多,结合反应所使用的溶液是重要原因之一。必须使用适合的缓冲液,有特定的pH和盐浓度,可能还需要添加互作所需的辅助因子。IP 或Co-IP 中用于纯化的抗体是影响得率的另一个重要因素。如果抗体本身易失活或与抗原结合微弱,则可能很难找到足够温和的条件,即能产生结合,又能保证在孵育和洗涤过程中结合可以稳定保持。
2. 抗原洗脱水平低
在某些情况下,抗原与抗体或结合蛋白结合之间可能会发生极强的相互作用,传统的洗脱缓冲液无法将其破坏。如果需要使用温和洗脱缓冲液收集功能性抗原,则上述矛盾尤为突出。
免疫共沉淀分析(Co-IP)与IP十分类似,基本的技术都是采用目标抗原特异性的固相化抗体;但IP的目标是纯化单一抗原,而Co-IP旨在分离抗原及与抗原结合的蛋白质或配体。
在Co-IP实验中,已知抗原称为诱饵蛋白,与之结合的蛋白则称为靶蛋白。靶蛋白可能是一些复杂的伴侣蛋白、信号分子、结构蛋白、辅助因子等,蛋白间相互作用强度范围可能介于高度瞬时和十分稳定之间。
基本的Co-IP实验方案与IP相同,实际上任何IP系统均可用于Co-IP。但是,还有许多其他因素需要考虑,例如,结合和洗涤条件的优化,优化时,需要考虑到诱饵蛋白-靶蛋白的相互作用强度以及抗体-诱饵蛋白的亲和力。
免疫沉淀ChIP抗体的选择?
免疫沉淀实验中抗体的选择非常关键,因为抗体的特异性和亲和力直接影响到实验的成功与否。
1. 特异性:抗体应当对目标蛋白具有高度的特异性,以避免与其他蛋白发生非特异性结合,导致假阳性结果。
2. 亲和力:抗体对目标蛋白的亲和力要足够高,以确保在免疫沉淀过程中能够有效地捕获目标蛋白。
3. 抗体类型:单克隆抗体提供更高的特异性和批间一致性,而多克隆抗体可能提供更强的结合能力和更广的表位覆盖。
4. 应用验证:选择已经过验证的抗体,这增加了实验成功的可能性。
5. 供应商信息:选择信誉良好的抗体供应商,并查看供应商提供的技术数据和客户评价,以帮助做出决策。
免疫沉淀技术ChIP的实验设计。北京RIP免疫沉淀磁珠多少钱
免疫沉淀IP技术选琼脂糖珠还是磁珠?南京RIP免疫沉淀磁珠货期
真核生物的基因组 DNA 以染色质(Chromatin)的形式存在。因此,研究蛋白质与 DNA 在染色质环境中的相互作用是阐明真核生物基因表达机制的基本途径,而染色质免疫共沉淀(Chromatinimmunoprecipitation,ChIP)技术是目前公认的研究此相互作用的选择,是真核生物基因表达机制研究中不可或缺的技术之一。
它的基本原理是在活细胞状态下,固定蛋白质-DNA(染色质)复合物,并将其切断为一定长度范围内的染色质小片段,然后通过免疫学方法(抗体亲和)沉淀此复合体,特异性地富集目的蛋白结合的 DNA,通过对目的片段的纯化与后期检测,从而获得蛋白质与 DNA 相互作用的信息。
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