三、流式细胞仪分析1、取对数生长期的细胞，接种到孔板，过夜培养。2、如果要进行药物刺激，在细胞中加入感兴趣的药物进行干预，继续培养一定时间后，收集细胞，PBS清洗2次。3、加入Rhodamine123工作液重悬细胞，37℃避光孵育15min或更长时间。【注意】：由于细胞种类和实验体系不同，Rhodamine123工作液浓度和孵育时间可以根据预实验或参考文献自行调整。4、用流式细胞仪检测。
四、实验案例1、取对数生长期A549细胞接于六孔板（1*106+2mlDMEM培养基）,37℃培养箱培养4-24h待其贴壁，以便后续实验操作.2、弃掉培养液，PBS洗涤两次.3、用培养基（无血清）稀释Rh123母液制备1～20µMRh123工作液。具体工作浓度取决于细胞类型和细胞浓度。4、将Rh123工作液加入六孔板并在37℃下孵育30分钟.5、去除Rh123工作液并用PBS洗涤三次细胞去除背景色.6、荧光显微镜观察. 吲哚菁绿（Indocyanine Green，简称ICG）是一种广泛应用于医学和生物领域的荧光染料。大连荧光染料脂溶
纳米粒子纳米颗粒是指尺寸在1到100纳米之间的颗粒。由于它们的小尺寸，纳米粒子通常用于不同类型的细胞和组织的荧光成像。当今生物成像中常用的一些纳米材料包括碳点、贵金属纳米颗粒、聚合物点、量子点和荧光掺杂二氧化硅等。在成像中，与其他分子荧光团和探针相比，纳米颗粒/纳米材料具有多种优势，使其成为理想的选择。除了提高亮度外，纳米粒子是惰性的并且往往分布均匀，这有助于在成像过程中获得更好的结果。此外，与各种分子荧光团相比，纳米颗粒和纳米材料没有细胞毒性，并且不受非特异性结合问题的影响。由于这些特性，大多数荧光纳米颗粒（染色纳米颗粒）可以内化到细胞/组织中，并容易靶向给定部位。大连荧光染料脂溶PI常用于细胞凋亡(apoptosis)或细胞坏死(necrosis)的检测，常用于流式细胞仪分析。
3.粘壁细胞的染色（1）使粘壁的细胞在无菌实验室培养。（2）从培养基中移走盖玻片，吸走过量培养液，将盖玻片放在潮湿的环境中。（3）在盖玻片的一角加入100μL的染料工作液，轻轻晃动使染料均匀覆盖所有细胞。（4）在37℃培养细胞2～20分钟，不同的细胞比较好培养时间不同。（5）吸干染料工作液，用培养液洗盖玻片2～3次，每次用预温的培养基覆盖所有细胞，培养5～10分钟，然后吸干培养基。
4.显微镜检测（1）DiD，DiO，DiI，DiR和DiS滤光器的选择参见表1。（2）多色染料的同时检测，滤光器按照以下设定：a)DiI和DiO＝OmegaXF52，Chroma51004；b)DiI和DiD＝OmegaXF92，Chroma51007；c)DiI，DiO和DiD＝OmegaXF93，Chroma61005
5.流式细胞仪的检测DiD，DiO，DiI，DiR和DiS染色的细胞可以分别用经典的FL1，FL2，FL3和FL4流式细胞仪检测。
罗丹明属于呫吨族。与市场上的许多其他染料相比，罗丹明具有出色的光稳定性以及许多光物理特性，使其非常适合用作激光染料、荧光探针和颜料。它们在聚合物纳米粒子表面的表征、聚合物-生物偶联物的检测、活细胞的成像以及寡核苷酸在胶乳上的吸附分析等方面特别有用。罗丹明荧光染料的衍生物也用作：分子开关，病毒表面修饰，化学传感器，硫醇。不同类型的染料通过它们各自的取代基（R1、R2、R3、R4和G）来区分。由于它们的差异，这些荧光染料在溶液中也表现出不同的光物理特性（例如不同的荧光寿命和发射比较大值）。氨基被刚性化的罗丹明染料无论温度范围如何都表现出高量子产率，而在每个氮处具有两个烷基取代基的那些表现出活化的内部转化，量子产率和荧光寿命随温度的变化而变化。罗丹明101和罗丹明B是一些**常用的罗丹明染料具有以下特点：--羧基倾向于在酸性溶液中质子化--染料转化为两性离子碱性溶液--两性离子染料在极性较小的有机溶剂中变为无色内酯要将罗丹明用作荧光探针，必须对其进行修改。这可以通过(thexanthenemoiety)氨基、羧基苯基环或羧酸基团的修饰来实现。与TRITC一样，罗丹明(NHS-rhodamine)的荧光特性为544nm（比较大吸收波长）和576nm（比较大发射）。D-荧光素钾盐南京星叶生物科技有限公司。
荧光染料***用于生物学和医学研究中，如流式细胞术、荧光显微镜和免疫组化等，其中荧光淬灭是一个关键的考量因素，因为它直接影响到实验结果的可靠性和准确性。FITC（异硫氰酸荧光素）是一种常用的绿色荧光染料，具有较高的荧光量子产率和激发效率。然而，FITC的一个主要缺点是容易受到环境因素的影响，如pH值、温度、溶剂和离子强度等，从而导致荧光淬灭。此外，FITC的光稳定性相对较低，长时间的光照会导致其荧光强度降低。CY5.5是一种远红外荧光染料，具有较长的激发和发射波长，因此适用于多色荧光标记和深组织成像。CY5.5相对于FITC来说，具有更好的光稳定性，不易受到环境因素的影响。此外，CY5.5的荧光量子产率也较高，使其在荧光标记实验中表现出色。AlexaFluor647是另一种常用的红色荧光染料，具有与CY5.5相似的长波长激发和发射特性。AlexaFluor647的优点是光稳定性较好，可以承受长时间的光照而不易淬灭。此外，它在多种溶剂和pH值范围内都能保持稳定的荧光性能，因此在复杂的生物样本中表现出色。
南京星叶生物科技有限公司Super Fluor系列（效果同Alexa Fluor 系列），质优价廉。 Super Fluor 750（效果同Alexa Fluor 750）荧光染料。大连荧光染料脂溶
SUPER Green I核酸染料特点 。大连荧光染料脂溶
DiD，DiO，DiI，DiR和DiS染料是一族亲脂性的荧光染料，可以用来染细胞膜和其它脂溶性生物结构。当与细胞膜结合后其荧光强度**增强，这类染料有着很高的淬灭常数和激发态寿命。一旦对细胞染色，这类染料在整个细胞膜上扩散，比较好浓度时可以使整个细胞膜染色。它们的荧光颜**分明显：DiI（橙色荧光），DiO（绿色荧光），DiD（红色荧光）和 DiR （深红色荧光）这使得他们可以用来对活细胞进行多色成像和流式分析。DiI和DiO可以分别用标准的 FITC和TRITC的滤光片。DiD可以用 633 nm He–Ne 激光器激发，有着比DiI更长的激发波长和发射波长，在细胞和组织染色中更有价值。 DiR的红外荧光可以穿透细胞和组织，在***成像中用来示踪。大连荧光染料脂溶
