企业商机
免疫沉淀基本参数
- 品牌
- 世途科生物
- 产品名称
- 免疫沉淀磁珠Protein A/G
- 有效期
- 12个月
免疫沉淀企业商机
免疫沉淀技术（Immunoprecipitation, IP）的实验方法通常包括以下步骤：
1. 样本准备
2. 蛋白质浓度测定：使用BCA、Bradford或Lowry等方法测定裂解液中蛋白质的浓度。
3. 抗体预处理：如果使用预固定的抗体，需先将抗体固定在固相支持物上，如琼脂糖珠或磁性微珠。
4. 免疫沉淀反应：将裂解液与特异性抗体（固定或未固定）混合，并在4°C下缓慢摇晃孵育过夜，以允许抗体与目标蛋白质充分结合。
5. 固相支持物的回收：对于未固定的抗体，加入与抗体特异性结合的蛋白A或蛋白G结合的固相支持物。
6. 洗涤：去除未结合的蛋白质和杂质，通常需要多次洗涤固相支持物。
7. 洗脱：使用适当的洗脱缓冲液（如加热的SDS加载缓冲液或酸性缓冲液）从固相支持物上洗脱免疫复合物。
8. 后续分析：对洗脱的蛋白质进行SDS-PAGE电泳、Western Blot、质谱分析等，以进一步分析目标蛋白质。
免疫沉淀技术Co-IP实验步骤。蛋白免疫沉淀外包公司
免疫沉淀技术的实验设计通常包括以下几个关键步骤：
1. 目标蛋白质的选择：
2. 抗体的选择：选择特异性强、亲和力高的抗体来捕获目标蛋白质
3. 样本的准备：收集和准备细胞或组织样本。
4. 蛋白质的裂解和释放：选择合适的裂解条件，如pH值、离子强度、去污剂等。
5. 蛋白质浓度的测定：确定裂解液中蛋白质的浓度，以便于后续步骤的标准化。
6. 免疫沉淀的操作：将特异性抗体与裂解液混合，并在适宜的条件下孵育，以形成抗体-抗原复合物。
7. 非特异性结合的减少：通过预纯化步骤去除可能的非特异性结合蛋白。
8. 洗涤：多次洗涤以去除未结合的蛋白质和杂质。
9. 目标蛋白质的洗脱：使用适当的缓冲液洗脱抗体-抗原复合物。
10. 后续分析：对洗脱的蛋白质进行进一步分析，如Western Blot.
11. 对照实验：设计适当的正对照和负对照，以评估实验的特异性和敏感性。
上海蛋白免疫沉淀磁珠应用免疫沉淀技术IP实验步骤。
免疫沉淀纯化所得抗原量低有多种原因，
A. 纯化所得抗原量低
1. 抗原结合水平低
IP 应用中出现低抗原结合水平的可能原因有很多，结合反应所使用的溶液是重要原因之一。必须使用适合的缓冲液，有特定的pH和盐浓度，可能还需要添加互作所需的辅助因子。IP 或Co-IP 中用于纯化的抗体是影响得率的另一个重要因素。如果抗体本身易失活或与抗原结合微弱，则可能很难找到足够温和的条件，即能产生结合，又能保证在孵育和洗涤过程中结合可以稳定保持。
2. 抗原洗脱水平低
在某些情况下，抗原与抗体或结合蛋白结合之间可能会发生极强的相互作用，传统的洗脱缓冲液无法将其破坏。如果需要使用温和洗脱缓冲液收集功能性抗原，则上述矛盾尤为突出。
Co-IP（Co-Immunoprecipitation，共免疫沉淀）的实验方法通常包括以下步骤：
1. 细胞培养与裂解：细胞在适宜的培养条件下生长到适当的密度。
蛋白质分离：裂解后的细胞混合物通过离心去除未破碎的细胞碎片和未裂解的细胞。收集上清液
2. 抗体的添加：将特异性抗体（针对目标蛋白质的抗体）加入到裂解物中。
3. 免疫复合物的形成：抗体与目标蛋白结合后，形成免疫复合物。
4. 亲和介质的使用：向混合物中添加蛋白A或蛋白G结合的珠子（如琼脂糖或磁性珠子）。
5. 免疫复合物的捕获：将混合物与珠子孵育一段时间后，使用磁铁或离心的方法将珠子收集起来，同时捕获了与之结合的免疫复合物。
6. 洗涤：洗涤珠子以去除未特异性结合的蛋白质和其他分子。
7. 洗脱：使用适当的缓冲液将免疫复合物从珠子上洗脱下来，常用的缓冲液包括SDS样品缓冲液，用于后续的电泳分析。
8. 蛋白质分析：洗脱的蛋白质可以通过SDS-PAGE凝胶电泳、Western blot、质谱分析等方法进行进一步分析。
9. 实验对照：实验中应包括阳性对照和阴性对照，以确保实验结果的可靠性。
10. 数据分析：对实验结果进行分析，确认目标蛋白是否成功沉淀，并鉴定任何可能的相互作用蛋白。
免疫沉淀技术Co-IP的优缺点是什么？
RIP实验步骤通常包括：
1. 细胞收集与交联：培养细胞至适当密度。使用交联剂（如甲醛）进行交联，以固定蛋白质-RNA复合物。
2. 细胞裂解：收集细胞并进行裂解，释放RNA-蛋白质复合物。在裂解过程中添加蛋白酶抑制剂以防止蛋白质降解。
3. 超声处理：使用超声波破坏细胞，获得更小的染色质片段，这有助于后续步骤中抗体的接触。
4. 除去细胞碎片：通过离心去除细胞碎片和未裂解的细胞，收集含RNA-蛋白质复合物的上清液。
5. 免疫沉淀：将针对特定RNA结合蛋白（RBP）的抗体加入到上清液中。孵育一段时间，使抗体与目标蛋白充分结合。
6. 捕获免疫复合物：添加蛋白A或蛋白G结合的磁珠或琼脂糖珠。孵育使抗体-蛋白质-RNA复合物与珠子结合。
7. 洗涤：多次洗涤珠子以去除未特异性结合的蛋白质和RNA。
8. 洗脱与逆转交联：使用适当的缓冲液洗脱免疫复合物。使用蛋白酶K处理样品以逆转交联，释放RNA。
9. RNA提取与纯化：从免疫沉淀样品中提取RNA，并进行纯化。
10. RNA分析：使用qPCR、Northern blot、RNA-Seq等方法分析沉淀的RNA，以确定与目标蛋白相互作用的RNA种类。
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ChIP（染色质免疫沉淀）实验是一种用于研究蛋白质与DNA相互作用的技术。以下是ChIP实验的实验设计概述：
1. 目标蛋白的选择：确定您想要研究的目标蛋白，例如特定的转录因子或组蛋白修饰。
2. 样本的准备：根据研究的需要选择合适的细胞或组织样本。
3. 抗体的选择：选择具有高特异性和亲和力的抗体，这对于实验的成功至关重要。
4. 交联：使用甲醛等交联剂将蛋白质与DNA在体内共价结合，形成稳定的蛋白质-DNA复合物。
5. 细胞裂解：裂解细胞以释放染色质，同时保持蛋白质-DNA复合物的完整性。
6. 染色质的剪切：通过超声或酶消化将染色质剪切成适当大小的片段，通常在200-1000 bp之间。
7. 免疫沉淀：使用特定抗体与目标蛋白结合，然后利用蛋白A/G磁珠沉淀复合物。
8. 洗涤和洗脱：洗涤沉淀物以去除未特异性结合的蛋白质和DNA，然后洗脱目标蛋白-DNA复合物。
9. 逆转交联：使用蛋白酶K处理样品以逆转交联，释放DNA。
10. DNA的纯化和分析：纯化DNA并使用qPCR、芯片或测序技术（如ChIP-seq）进行分析。
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