“免疫沉淀”一般是指采用固定在固相支持物上的结合蛋白,进行小规模的蛋白质亲和纯化的实验。更确切地说,IP是采用固定在微珠支持物(一般是琼脂糖树脂)上的特定抗体,从复杂的混合物中,纯化单一抗原的实验。固定化蛋白质复合物的组装既可以分步进行,也可以一步完成。
常见的加样顺序:抗体和样本(如细胞裂解物)一起孵育,然后加入亲和微珠,用于捕获抗体-抗原复合物。也可以将抗体和微珠(通过抗体结合蛋白,如蛋白A、G或A/G等,直接或间接结合抗体)先进行孵育,然后再加入含有抗原的样本。当抗原、抗体和固相支持物产生结合以后,充分洗涤微珠,再采用适当的洗脱缓冲液从支持物上洗脱抗原。
免疫沉淀Co-IP抗体的选择?南京免疫沉淀技术服务
Co-IP(免疫共沉淀)技术主要用于研究蛋白质之间的相互作用,其应用场景如下:
1. 蛋白质相互作用网络的鉴定:Co-IP可用于构建蛋白质相互作用网络,发现目标蛋白的结合伙伴。
2. 信号传导途径的研究:通过Co-IP技术,科学家们发现了许多关键的细胞信号通路,如MAPK和PI3K/Akt通路等,为深入理解这些通路的功能和调控机制提供了重要线索。
3. 药物靶点筛选:利用Co-IP技术,研究人员可以筛选潜在的药物靶点。
疾病机制研究:通过分析疾病相关蛋白质的相互作用,Co-IP有助于揭示疾病的分子机制。
4. 抗体药物开发:Co-IP可用于研究抗体药物与其靶标蛋白的结合特性,评估抗体药物的亲和力和特异性。
5. 转录因子研究:Co-IP技术可以用于研究转录因子与蛋白质的相互作用,进而揭示基因调控网络。
北京RIP免疫沉淀磁珠货期免疫沉淀技术ChIP实验步骤。
免疫沉淀技术RIP(RNA Immunoprecipitation,RNA免疫沉淀)的实验方法基于以下几个关键步骤:
1. 细胞裂解:首先,细胞或组织样本被裂解,以释放细胞内的蛋白质和RNA复合物。
2.抗体特异性结合:裂解后的样本中加入针对特定RNA结合蛋白的抗体。这些抗体能够特异性地识别并结合到目标蛋白。
3. 免疫复合物形成:抗体与目标蛋白结合后,形成抗体-蛋白质-RNA复合物。
4. 亲和介质捕获:使用蛋白A或蛋白G结合的珠子(如琼脂糖或磁性珠子)来捕获这些抗体-蛋白质-RNA复合物。蛋白A或蛋白G能够与抗体的Fc部分结合,从而拉下与之结合的复合物。
5. 洗涤:捕获的复合物被洗涤以去除未特异性结合的蛋白质和RNA。
6. RNA分离和分析:从珠子上洗脱或消化复合物,分离出RNA,并进行进一步的分析,如qPCR、Northern blot或高通量测序(RNA-Seq)。
免疫沉淀(IP)实验中抗体的选择非常关键,因为抗体的特异性和亲和力直接影响到实验的成功与否。
1. 特异性:抗体应当对目标蛋白具有高度的特异性,以避免与其他蛋白发生非特异性结合,导致假阳性结果。
2. 亲和力:抗体对目标蛋白的亲和力要足够高,以确保在免疫沉淀过程中能够有效地捕获目标蛋白。
3. 抗体类型:单克隆抗体和多克隆抗体都可以用于IP实验。单克隆抗体提供更高的特异性和批间一致性,而多克隆抗体可能提供更强的结合能力和更广的表位覆盖。
4. 应用验证:选择已经过免疫沉淀(IP)或相关应用(如Western blot, IHC)验证的抗体,这增加了实验成功的可能性。
5. 供应商信息:选择信誉良好的抗体供应商,并查看供应商提供的技术数据和客户评价,以帮助做出决策。
免疫沉淀RIP抗体的选择?
免疫沉淀IP实验中磁珠还是琼脂糖珠的选择取决于客户实验情况。
琼脂糖珠海绵状的结构 (直径 50-150 μm) 可以结合抗体 (继而结合靶蛋白) ,它能够直接高效、快速结合抗体,而不需借助特殊的专业设备。琼脂糖珠呈多孔结构,这使得它们拥有更大的表面积可与蛋白质相互接触,具有更高的结合载量。
与琼脂糖珠不同,磁珠是固体,抗体的结合限于磁珠的表面。磁珠 (直径 1-4 μm) 明显小于琼脂糖珠 ,尽管磁珠没有多孔中心增加结合能力,但每体积的磁珠数量比琼脂糖珠多,使磁珠拥有足够的抗体结合表面积满足高容量的抗体结合。
简而言之,琼脂糖珠的结合能力较强,而磁珠在得率,可重复性以及自动化方面有明显的优势。
免疫沉淀技术IP是什么?北京RIP免疫沉淀磁珠货期
免疫沉淀技术RIP的实验设计。南京免疫沉淀技术服务
免疫共沉淀分析(Co-IP)与IP十分类似,基本的技术都是采用目标抗原特异性的固相化抗体;但IP的目标是纯化单一抗原,而Co-IP旨在分离抗原及与抗原结合的蛋白质或配体。
在Co-IP实验中,已知抗原称为诱饵蛋白,与之结合的蛋白则称为靶蛋白。靶蛋白可能是一些复杂的伴侣蛋白、信号分子、结构蛋白、辅助因子等,蛋白间相互作用强度范围可能介于高度瞬时和十分稳定之间。
基本的Co-IP实验方案与IP相同,实际上任何IP系统均可用于Co-IP。但是,还有许多其他因素需要考虑,例如,结合和洗涤条件的优化,优化时,需要考虑到诱饵蛋白-靶蛋白的相互作用强度以及抗体-诱饵蛋白的亲和力。
南京免疫沉淀技术服务