蛋白质的N-糖基化特征是一个关键的质量属性。它会影响生物制药的安全性和有效性，因此需要在开发和生产过程中进行表征和监测。常见的聚糖分析工作流程是用PNGase F释放N-聚糖，然后用荧光标记物（如2-AB、2-AA、普鲁卡因胺或RapiFluor-MS™（沃特世公司））标记生成的聚糖。然后使用HILIC-HPLC或毛细管电泳分离标记的聚糖，以表征和定量不同的聚糖结构。 在这里，使用游离聚糖方法分析zhiliao性抗体曲妥珠单抗、Fc-融合蛋白依那西普和糖蛋白RNase B的N-聚糖。曲妥珠单抗和依那西普在天然条件下在37°C下用Genvois的PNGase F去糖基化1小时，而RNase B需要变性和还原才能完全去糖基化。因此，在50°C下用PNGase F去糖基化10分钟之前，用RapiGest™ SF表面活性剂（沃特世公司）和TCEP处理RNase B。 用RapiFluor-MS标记所得游离的聚糖，并通过HILIC UPLC-FLD-MS进行分析。生物制剂的表征和质量控制过程中确定电荷变体；河北用于自动化系统的96孔板形式PNGaseF去糖基化酶生物药物开发
Genovis的SialEXO固定化用于复杂糖蛋白的去唾液酸化：在设置反应条件时，需要在所需的反应时间和完成反应所需的酶量之间进行权衡。较高的酶量可保证在更短的时间内完成周转，但会使下游分析复杂化。为了避免此类问题，我们以离心柱形式固定了活性SialEXO。这允许以更短的孵育时间孵育具有明显更高量的唾液酸酶的糖蛋白底物。Genovis测试了 SialEXO 冻干和 SialEXO 固定化在人 C1 抑制剂上的性能。这种糖蛋白是一种具有挑战性的底物，具有 6 个 N- 和多达 26 个 O-聚糖，由 α2,3 和 α2,6 连接的唾液酸修饰。对游离的N-聚糖的分析表明，SialEXO在溶液中完全脱唾液酸化，SialEXO固定化。河北用于自动化系统的96孔板形式PNGaseF去糖基化酶生物药物开发GalNAcEXO酶是可降低样品异质性，用于分析携带α连接的 GalNAc 残基作为未成熟截短he心 1 的复杂 O-糖蛋白。
Genovis的ImpaRATOR™ 可用于多种 O-聚糖：依那西普是一种融合蛋白，由TNF受体的胞外结构域与人IgG1的Fc部分相连。该蛋白质在Fc区域上方含有多达13个O-糖基化的Ser/Thr残基簇，使其成为一种非常难以在结构上表征的生物制药。为了证明ImpaRATOR的聚糖特异性，制备了三种具有不同聚糖组成的依那西普样品：（i）携带单唾液酸和二唾液酸化he心1结构混合物的未经处理的糖蛋白，（ii）用SialEXO处理的糖蛋白去除唾液酸并产生裸核1结构，以及（iii）用SialEXO和GalactEXO处理的糖蛋白产生单个GalNAc残基， 也称为Tn抗原。用ImpaRATOR和FabRICATOR在一锅反应中处理三个样品（图1）。作为比较，SialEXO处理的依那西普用OpeRATOR和FabRICATOR处理。将所得肽还原、烷基化并用HILIC-MS进行分析。FabRICATOR被包括在反应中，以将Fc区与大多数C端糖肽分离，以促进其表征。
genovis的FucosEXO在生理缓冲液和中性pH值中具有活性，使其与大多数样品相容。此外，FucosEXO活性不依赖于任何可能影响LC-MS分析的辅因子，如BSA。根据底物的性质，FucosEXO 可在 1 至 2 小时内水解糖蛋白上的末端 α1-2,3,4 连接的岩藻糖残基，而对于非常复杂的样品可能需要更长的孵育时间。FucoseEXO也可固定在离心柱中，可快速方便地处理高达0.5mg的糖蛋白。使用离心柱形式，将糖蛋白样品与固定化的FucosEXO树脂一起孵育，然后在离心步骤中轻松收集消化的糖蛋白。PNGase F去除N-糖，被用于MS分析的样品制备，以降低蛋白质的异质性，分析游离的糖，并研究N-糖的功能作用。
genovis分析依那西普和曲妥珠单抗游离聚糖：为了确认依那西普和曲妥珠单抗中半乳糖损失的LC-MS数据，进行了释放的N-聚糖分析。标记的N-聚糖的分离清楚地表明了依那西普和曲妥珠单抗上半乳糖的丢失，如半乳糖基化聚糖物种的信号丢失所示。该酶是一种有价值的工具，可降低样品异质性，用于分析携带α连接的 GalNAc 残基作为未成熟截短he心 1 的复杂 O-糖蛋白。1. 高效 α-N-乙酰半乳糖胺酶 – 快速、完全去除 Tn-抗原和 α1-3-连接的 GalNAc；2. 实现完全糖基去除，以改善蛋白质表征；3. 可固定在即用型离心柱中。GalactEXO由两种半乳糖苷酶组成，均带有His标签，组分的分子量为87 kDa和109 kDa。河北用于自动化系统的96孔板形式PNGaseF去糖基化酶生物药物开发
O-连接聚糖通常存在于蛋白质的暴露位置，因为它们在蛋白质折叠发生后附着。河北用于自动化系统的96孔板形式PNGaseF去糖基化酶生物药物开发
我们展示了使用两种蛋白作为底物的OmniGLYZOR的性能。依那西普是一种 Fc 融合蛋白，含有 TNFα 受体的胞外结构域。该结构域用 2 个 N-糖和 8-11 个 1 个具有不同程度唾液酸化的 O-聚糖修饰。在 37°C 下将这种重糖基化蛋白在 OmniGLYZOR Microspin 柱上孵育 1 小时，可完全去除所有 N-和 O-糖，如中级 LC-MS 分析所示。促红xibao生成素 （EPO） 是一种携带 3 个 N-聚糖和 1 个he心 1 个 O-聚糖的小蛋白质，其总质量的近 40% 由聚糖组成。O-连接聚糖通常存在于蛋白质的暴露位置，因为它们在蛋白质折叠发生后附着。只有负责其合成的糖基转移酶才能接触到这些暴露的位点。河北用于自动化系统的96孔板形式PNGaseF去糖基化酶生物药物开发
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