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细胞实验外包蓝白班筛选实验的原理是什么?一些载体(如PUC系列质粒)带有β-半乳糖苷酶(lacZ)N端α片段的编码区,该编码区中含有多克隆位点(MCS),可用于构建重组子。这种载体适用于只编码β-半乳糖苷酶C端ω片段的突变宿主细胞。因此,宿主和质粒编码的片段虽都没有半乳糖苷酶活性,但它们同时存在时,α片段与ω片段可通过α-互补形成具有酶活性的β-半乳糖苷酶。这样,lacZ基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补。由α-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)的作用下,在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落。而当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后,几乎不可避免地破坏α片段的编码,使得带有重组质粒的LacZ-细菌形成白色菌落。这种重组子的筛选,称为蓝白斑筛选。
细胞爬片是细胞实验中常用的实验方法之一:使用细胞爬片时(比如在六孔板中放入爬片,六孔板的孔底面积往往会比爬片面积多出一部分,加细胞悬液时常常就是细胞铺满整个孔底,有时细胞生长边集现象,就是靠近壁边缘密度要高些,这样处于玻片上爬的细胞数量就可能相对较少)比较好的做法是将玻片放入孔板的孔内后,加细胞悬液时只滴到玻片上,一直滴到液体布满整个玻片又不会溢出玻片边缘(因为液体表面张力作用可以很容易做到这一点!),放在培养箱里,等细胞贴壁后,取出,再滴加培养基布满整个孔底,继续培养,这样玻片上的细胞生长的密度就会很集中。细胞实验外包技术的难点在什么地方?
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