1、RNA样本制备
将样本按Trizol抽提说明书进行总RNA提取，利用琼脂糖凝胶电泳检测提取效果，并进行质检（OD260/280≥1.9）
2、测序文库构建
我们采用标准提取方法从组织或细胞中提取RNA，随后对RNA样品进行严格质控，质控标准主要包括以下几个方面：
（1）1%的琼脂糖电泳检测RNA样品是否有降解以及杂质；
（2）Qubit2.0 Fluorometer：RNA浓度精确定量；
（3）Qsep核酸检测仪（BiOptic Inc.）检测RNA样品的完整性和浓度。
转录组测序进行RNA的研究具有十分多的优点，包括可以检测表达量变化、也可对可变剪接和SNP进行研究、背景噪音小，无信号过饱和问题、数read的数目，所以精确度比基因芯片要高，且可重复性好、无克隆步骤，所以对样品量的要求更低等。获得了测序的原始数据后，我们如何进行数据分析
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其中基因数据库（GENES Database）含有所有已知的完整基因组和不完整基因组。有细菌、蓝藻、真核生物等生物体的基因序列，如人、小鼠、果蝇、拟南芥等等；通路数据库（PATHWAY Database）储存了基因功能的相关信息，通过图形来表示细胞内的生物学过程，例如代谢、膜运输、信号传导和细胞的生长周期；配体数据库（LIGAND Database）包括了细胞内的化学复合物、酶分子和酶反应的信息。
对KEGG中每个Pathway应用超几何检验进行富集分析，找出差异表达基因显性富集的Pathway 四川BCR转录组测序公司哪里有上海哪家做转录组好找融享生物。
1 转录组与基因组的区别
以DNA为模板合成RNA的转录过程是基因表达的第一步，也是基因表达调控的关键环节。因此,转录组通过转录过程来源于基因组，但与基因组相比较，信息量相对较小，原因是*有很少的基因组DNA被转录。如人类基因组包含有30亿个碱基对，其中大约只有3万~4万个基因转录成mRNA分子，只占总长度的1.5%。个体的基因组是相对稳定的，但其转录组却包含了时间和空间上的限定。同一细胞在不同的生长时期及生长环境下,其基因转录表达情况是不完全相同的。例如,幼年的神经干细胞和成熟分化的神经元，其基因表达谱的不同。同一个体的不同细胞基因表达谱也不一样，即通过转录表达谱区别于其他组织，如脑组织和血管组织等都具有各自特异的基因表达谱而显示出组织的特异性。同样的，我们的机体在正常与疾病状态下，转录组表达谱也会发生比较大的变化，通过正常对照与疾病组的转录组学比较，就可以筛选出差异基因表达谱，用于疾病的早期诊断、用药效果及愈后评估。
问：差异基因筛选条件比较大能设的阈值是多少？很多客户希望通过调整差异基因筛选阈值来找相关基因是否有必要？
答：差异基因的筛选是基于统计学意义的，不能直观的通过两个数值的大小判断是否为差异基因：
首先：受测序深度的影响，有些样品的测序深度较深，可能导致该样品的readcount数值较高，做差异分析的第一步就是要消除测序深度的影响，对原始数据进行标准化处理（我们在有重复项目中，使用DESeq标准化方法；无重复项目中，使用TMM标准化方法）
其次：在差异分析过程中，需要对readcount的分布进行估计，经验表明，readcount服从负二项分布。在有重复的项目中，重复的好坏也会对差异基因与否产生影响。如果重复较差，组内差异情况会屏蔽掉部分组间的差异。在估计完参数后，需要用特定检验方法来判断差异基因与否
再次：在计算完pvalue以后，需要对pvalue进行多重假设检验校正，来减少假阳性。这个过程会使得padj会大于原来的pvalue，使得部分通过pvalue阀值的基因，无法通过padj的阀值。
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相对于传统的芯片杂交平台，转录组测序无需预先针对已知序列设计探针，即可对任意物种的整体转录活动进行检测，提供更精确的数字化信号，更高的检测通量以及更广的检测范围，是目前深入研究转录组复杂性的强大工具。普通转录组测序主要适用于两大类：一是不同的生长阶段或者发育过程；二是不同的环境、药物、病原菌等逆境胁迫处理。转录组测序所需数据量与所研究物种的基因组大小有关，基因组越大，则所需数据量越大。按照我们的经验来说：常规物种一般建议6G数据即可；基因组较大的物种推荐8G以上数据，比如：小麦建议10G数据起，甘蔗、甘薯建议至少8G数据。转录测序技术服务靠谱公司上海融享生物科技有限公司多年技术服务经验更放心。贵州宏转录组测序电话
融享生物是转录组测序/mRNA测序技术服务商之一，从事转录组测序/mRNA测序已经多年。四川BCR转录组测序公司哪里有
问：聚类分析是怎么做的？
答：聚类使用的为R中的聚类软件包pheatmap，所针对的数据为（差异基因的并集），以基因的表达水平值log10(FPKM+1)值进行聚类。其采用相应的距离算法，算出每个基因之间的距离，然后通过反复迭代，计算基因之间的相对距离，根据基因的相对距离远近来分成不同的subcluster，从而实现聚类。该软件包是**的，只需通过R来运行。
问：如何判断差异基因在两个样品间的差异大小？
答：差异的情况可通过|log2Foldchange|来判断，|log2Foldchange|越大，差异倍数越大。 四川BCR转录组测序公司哪里有
上海融享生物科技有限公司专注技术创新和产品研发，发展规模团队不断壮大。目前我公司在职员工以90后为主，是一个有活力有能力有创新精神的团队。上海融享生物科技有限公司主营业务涵盖转录组，16S ITS，靶向甲基化， LncRNA转录测序，坚持“质量保证、良好服务、顾客满意”的质量方针，赢得广大客户的支持和信赖。公司力求给客户提供全数良好服务，我们相信诚实正直、开拓进取地为公司发展做正确的事情，将为公司和个人带来共同的利益和进步。经过几年的发展，已成为转录组，16S ITS，靶向甲基化， LncRNA转录测序行业出名企业。
