Illumina高通量测序结果刚开始以原始图像数据文件存在，经CASAVA软件进行碱基识别（Base Calling）后转化为原始测序序列（Sequenced Reads），我们称之为Raw Data，其结果以FASTQ（简称为fq）文件格式存储。FASTQ文件包含每条测序序列（Read）的名称、碱基序列以及其对应的测序质量信息。在FASTQ格式文件中，每个碱基对应一个碱基质量字符，每个碱基质量字符对应的ASCII码值减去33（Sanger质量值体系），即为该碱基的测序质量得分。不同Score表示不同的碱基测序错误率，如Score值为20和30分别表示碱基测序错误率为1%和0.1%。 做全转录组基因测序服务就找融享生物靠谱又专业。贵州LncRNA转录组测序服务
问：Read-1,Read-2的具体含义是什么？答：双端测序会在cDNA片段的两端先后读取一定长度的碱基（如pe150，就是分别测150bp）得到一对reads，其中一条称为Read-1，另一条称为Read-2。大量文献和实际项目都表明，转录组分析中使用双端reads对于序列拼接和定量都大有裨益。
基因表达水平一般是通过该基因转录的mRNA的多少来衡量的。每个基因转录产生的mRNA的量，是受到时空等多种因素调控的，个体在不同的生长发育阶段，或者不同的组织水平,或者响应不同的实验处理，基因转录出mRNA的量都是不一样的。我们通过featurecounts(Liao Y, Smyth GK and Shi W., 2014)软件统计基因的表达量。 湖南医学转录组测序公司上海融享专注转录组测序。
问：差异基因筛选条件比较大能设的阈值是多少？很多客户希望通过调整差异基因筛选阈值来找相关基因是否有必要？
答：差异基因的筛选是基于统计学意义的，不能直观的通过两个数值的大小判断是否为差异基因：
首先：受测序深度的影响，有些样品的测序深度较深，可能导致该样品的readcount数值较高，做差异分析的第一步就是要消除测序深度的影响，对原始数据进行标准化处理（我们在有重复项目中，使用DESeq标准化方法；无重复项目中，使用TMM标准化方法）
其次：在差异分析过程中，需要对readcount的分布进行估计，经验表明，readcount服从负二项分布。在有重复的项目中，重复的好坏也会对差异基因与否产生影响。如果重复较差，组内差异情况会屏蔽掉部分组间的差异。在估计完参数后，需要用特定检验方法来判断差异基因与否
再次：在计算完pvalue以后，需要对pvalue进行多重假设检验校正，来减少假阳性。这个过程会使得padj会大于原来的pvalue，使得部分通过pvalue阀值的基因，无法通过padj的阀值。
问：能否用FPKM进行差异分析？
答：在做差异分析时，我们是采用readcount数据，通过DESeq或者TMM标准化后，进行差异分析。FPKM实际上也是对readcount进行标准化处理的一种方法，各种标准化方法优劣势比较见下图(Dillies, M. A. et al, 2013)，可以看出，在进行差异分析时，DESeq和TMM的标准化效果比较好，FPKM的标准化效果较差，所以，不推荐使用FPKM进行差异分析。
问：为什么要用校正后的p值，能直接用p_value吗？
答：校正后的p值（padj/qvalue），是对p值进行了多重假设检验，能更好地控制假阳性率 全基因组测序找上海融享生物科技有限公司。
1、RNA样本制备
将样本按Trizol抽提说明书进行总RNA提取，利用琼脂糖凝胶电泳检测提取效果，并进行质检（OD260/280≥1.9）
2、测序文库构建
我们采用标准提取方法从组织或细胞中提取RNA，随后对RNA样品进行严格质控，质控标准主要包括以下几个方面：
（1）1%的琼脂糖电泳检测RNA样品是否有降解以及杂质；
（2）Qubit2.0 Fluorometer：RNA浓度精确定量；
（3）Qsep核酸检测仪（BiOptic Inc.）检测RNA样品的完整性和浓度。
转录组测序进行RNA的研究具有十分多的优点，包括可以检测表达量变化、也可对可变剪接和SNP进行研究、背景噪音小，无信号过饱和问题、数read的数目，所以精确度比基因芯片要高，且可重复性好、无克隆步骤，所以对样品量的要求更低等。获得了测序的原始数据后，我们如何进行数据分析
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问：聚类分析是怎么做的？
答：聚类使用的为R中的聚类软件包pheatmap，所针对的数据为（差异基因的并集），以基因的表达水平值log10(FPKM+1)值进行聚类。其采用相应的距离算法，算出每个基因之间的距离，然后通过反复迭代，计算基因之间的相对距离，根据基因的相对距离远近来分成不同的subcluster，从而实现聚类。该软件包是**的，只需通过R来运行。
问：如何判断差异基因在两个样品间的差异大小？
答：差异的情况可通过|log2Foldchange|来判断，|log2Foldchange|越大，差异倍数越大。 贵州LncRNA转录组测序服务
上海融享生物科技有限公司主要经营范围是医药、保养，拥有一支专业技术团队和良好的市场口碑。公司自成立以来，以质量为发展，让匠心弥散在每个细节，公司旗下转录组，16S ITS，靶向甲基化， LncRNA转录测序深受客户的喜爱。公司将不断增强企业重点竞争力，努力学习行业知识，遵守行业规范，植根于医药、保养行业的发展。在社会各界的鼎力支持下，持续创新，不断铸造***服务体验，为客户成功提供坚实有力的支持。
