自噬通过分解并清理受损的蛋白质和细胞器来达到清洁细胞的效果,该过程对于神经元等寿命较长的细胞来说十分重要,由于神经元不再能够进行细胞分裂,因此特别容易积聚对自身有害的蛋白质和受损的细胞器。在他们的新研究中,科学家表明,老鼠大脑中的神经元不需要自噬就可以存活。此外,这些神经元细胞通过自噬相关蛋白来调节对学习和记忆至关重要的分子微管转运过程。自噬对大脑的健康至关重要,这一事实得到了近十年来科学发现的支持。科学家发现自噬的新功能表明,对患者自噬活性的诊治性调节不只可以促进脑部废物清理,还可以通过改变细胞内转运系统的效率来改变认知能力。研究主要集中在酵母及其它重要的单细胞真核生物,而对植物和哺乳动物细胞中的自体吞噬过程的了解则更少。山东western blot检测自噬
在研究自噬与凋亡的关系时,人们发现细胞死亡前胞浆中存在大量的自噬体或自噬溶酶体,但这样的细胞缺乏凋亡的典型特点,如核固缩),核破裂、细胞皱缩、没有凋亡小体的形成等,被称为自噬样细胞死亡,它是一种新的细胞程序性死亡,为了与凋亡区别,被命名为TypeIIcelldeath,相应的,凋亡为TypeIcelldeath,坏死为TypeIIIcelldeath。尽管这样,但对于自噬是否是细胞死亡的直接原因目前还存在比较大的争议。到底是Celldeathbyautophagy(自噬引起死亡)还是Celldeathwithautophagy(死亡时有自噬发生,但不是直接原因)?对此,自噬研究领域“大牛”级**LevineBeth在一篇nature的Review中表达了自己的观点。由于在形态学上2者无明显区别,但通过阻断自噬,观察细胞的结局可区分开来:Celldeathbyautophagy细胞存活,而Celldeathwithautophagy细胞死亡。自噬既能阻止也能促进细胞凋亡,两种反应在生物体内普遍存在。吉林自噬RFP-GFP-LC3B分子伴侣介导的自噬(CMA):胞质内蛋白结合到分子伴侣后被转运到溶酶体腔中,然后被溶酶体酶消化。
细胞经诱导或阻止后,需对自噬过程进行观察和检测,常用的策略和技术有:1、利用WesternBlot检测LC3-II/I比值的变化以评价自噬形成自噬形成时,胞浆型LC3(即LC3-I)会酶解掉一小段多肽,转变为(自噬体)膜型(即LC3-II),因此,LC3-II/I比值的大小可估计自噬水平的高低。(注意:LC3抗体对LC3-II有更高的亲和力,会造成假阳性。方法2和3需结合使用,同时需考虑溶酶体活性的影响。)2、检测长寿蛋白的批量降解:非特异。3、MDC(Monodansylcadaverine,单丹磺酰尸胺)染色:包括自噬体,所有酸性液泡都被染色,故属于非特异性的。4、CellTrackerTMGreen染色:主要用于双染色,但其能染所有的液泡,故也是属于非特异性的。
细胞自噬常用的检测方法:1.LC3turnover实验,单检测LC3-II的静态水平并不能够完全反映细胞内的自噬潮变化,需要联合自噬后期阻止剂如溶酶体阻止剂BafilomycinA1或CQ,来比较LC3-II在阻止剂加入前后的变化差异。2.绿色萤光蛋白(GFP)的抗降解性,通过检测转染了GFP-LC3的细胞所产生的GFP片段来评判细胞内自噬水平的变化。3.以p62蛋白作为自噬活性指标,经常被科研人员用作自噬水平升高的辅助检测手段,然而需联合其他检测手段进行证实。4.mRFP-GFP-LC3双萤光活细胞成像,实时动态监测自噬过程,并且能够通过颜色变化确定自噬潮水平的高低。5.使用电子显微镜,然而对实验设备和实验者的技能与辨别能力要求较高,有学者推荐进行双盲实验来定量细胞中自噬体或自噬溶酶体数量。6.流式细胞术,可以检测各个细胞时相的自噬水平,还可以直接计算出萤光强度和阳性细胞百分比,然而在细胞在染色之前,需要使用去垢剂预处理细胞质中的LC3-I。对抗关系中,自噬与凋亡的目标及过程背道而驰。
溶酶体的作用还包括对细胞内物质的消化,溶酶体能消化分解经胞吞作用摄入细胞内的各种物质和细胞内衰亡或损伤的各种细胞器等。吞噬性溶酶体内的各种大分子在水解酶的作用下,可被分解为简单物质。例如,能将蛋白质分解为二肽或游离氨基酸;把核酸分解为核苷和磷酸;使碳水化合物分解为寡糖类或单糖;将中性脂肪分解为甘油和脂肪酸等。这些被分解而生成的可溶性小分子物质,能透过溶酶体体膜进入细胞质基质,重新参与细胞的物质代谢,一些未被完全消化的物质残留下来,形成残余小体。对不同的细胞,自噬的作用可能不同。黑龙江GFP-LC3单荧光自噬慢病毒
在研究自噬相关蛋白时,需对其进行定位。山东western blot检测自噬
自噬与疾病:1、自噬与代谢:自噬能清理不正常构型的蛋白质,并消化受损和多余的细胞器,是真核细胞中普遍存在的降解/再循环系统。在细胞新陈代谢、结构重建、生长发育中起着重要作用。在饥饿和新生儿早期,自噬作用明显加强,自噬体明显增多。2、自噬与肿细胞:细胞自噬与细胞的关系十分复杂,目前尚未完全阐明。一方面,正常细胞自噬增强,可表现出阻止肿细胞发生的功能;与此相反,阻止细胞自噬有潜在的致瘤可能。另一方面,肿细胞也可通过增强细胞自噬来对抗由缺氧、代谢产物、诊治药物诱导的应激反应。山东western blot检测自噬
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