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Hepatic

stellate cell transdifferentiation involves genome-wide remodeling of the DNA

methylation landscape. J Hepatol. 2016;64(3):661-73. (IF= 14.911)

肝星状细胞(HSC)是导致肝纤维化发生和进展的关键细胞类型。DNA羟甲基化与转录***有关，其模式在人类疾病中经常发生改变。研究者采用简化基因组氧化-亚硫酸盐测序(RRBS/oxRRBS)检测静止和******状态的大鼠HSC细胞的5mC和5hmC水平，证实了5mC和5hmC在肝纤维化和HSC转分化过程中的整体变化，表明DNA甲基化/羟甲基化是HSC***的关键步骤，可能会为支持纤维生成的分子事件带来新的见解，并可能为疾病进展提供生物标志物以及潜在的新药物靶点。 ChIP-Seq 能实现真正的全基因组分析。重庆技术服务活动

相比之下，VeraCode GoldenGate甲基化分析技术更适合中通量的筛选及验证研究，它以以矩阵微珠芯片(Sentrix Array Matrix(SAM)）形式分析48至384个用户指定的CpG位点。首先，将亚硫酸氢盐处理的基因组DNA 与分析oligo混合，oligo与未甲基化位点的U互补，或者与甲基化位点的C互补。杂交之后，引物延伸，并连接上位点特异的oligo来产生通用 PCR的模板。***，用标记的PCR引物生成可检测的产物。据Illumina的产品**介绍，其产品的**优势在于单个CpG位点的分辨率。其它分析将甲基化定位在一段区域，而通过Illumina分析，你能精确测定某个CpG位点的甲基化水平。四川MeDIP-Seq技术服务经验丰富DNA甲基化多发生在CpG二核苷酸中的胞嘧啶的5位碳原子。

联合亚硫酸氢钠的限制性内切酶分析法（COBRA）

这种方法是将亚硫酸氢盐处理与酶切相结合来进行甲基化检测。DNA样本经亚硫酸氢盐处理后，利用PCR扩增。扩增产物纯化后用限制性内切酶（BstUI）消化。若其识别序列中的C发生完全甲基化(5mCG5mCG)，则 PCR扩增后保留为CGCG，BstU I能够识别并进行切割；若待测序列中，C未发生甲基化，则PCR后转变为TGTG，BstUI识别位点丢失，不能进行切割。这样酶切产物再经电泳分离、探针杂交、扫描定量后即可计算出原样本中甲基化的比例。

这种方法**的优点就是相对简单，可进行快速定量，且需要的样本量少。然而，它的局限性也十分明显，只能获得特殊酶切位点的甲基化情况，且阴性结果并不能排除样品DNA中存在甲基化的可能。

    DNA甲基化修饰类型。5mc是表观遗传**重要的一种修饰，***存在于植物、动物等真核生物基因组中，被誉为“第五碱基”；5hmc是***发现的一种修饰碱基，成为哺乳动物的“第六碱基”；6mA在细菌、藻类及动植物基因组中存在。1992年，Frommeretal.将重亚硫酸盐处理结合测序进行DNA甲基化检测。从此，BisulfiteSequencing（BS）成为金标准方案。其特点是：单碱基分辨率；结合测序。甲基化5mc检测的金标准——BisulfiteSequencing。Wholegenomebisulfitesequencing,WGBS——DNA甲基化检测**有力的工具。ImprovedReduceRepresentationBisulfiteSequencing,强化RRBS——高性价比DNA甲基化检测方案。TargetedBisulfiteSequencing,高通量BSP——目标位点/基因甲基化验证方案。 基因组DNA冰袋或者干冰运输。

    芯片平台作为目前比较成熟的筛选工具，已经在很多领域有了相应的应用。多家芯片公司在DNA甲基化这块儿有了相应的产品提供，其中应用**为***的就Agilent平台和Illumina平台，相应的产品包括AgilentHumanCpGIslandMicroarrayKit，InfiniumHumanMethylation27BeadChip和InfiniumHumanMethylation450KBeadChip。另外RocheNimbleGen和Affymetrix也有相应的芯片推出，但是NimbleGen的芯片今年下半年已经停产。不同的芯片平台，各自的实验过程也是不一样的。安捷伦前期采用的甲基化DNA免疫共沉淀（MeDIP）技术。将基因组DNA分成两份，一份用来做MeDIP，另一份作为对照。两个样品都标记荧光(富集的样品用Cy5标记，对照用Cy3标记)，然后与芯片杂交。芯片上每个探针的Cy5/Cy3强度比例显示出该区域的甲基化程度。 焦磷酸测序技术服务基于QIAGEN公司的PyroMark Q96 ID平台。重庆技术服务活动

RRBS开发的初衷就是为人和哺乳动物，提供全基因组范围的、高性价比的甲基化检测金标准方案。重庆技术服务活动

甲基化特异性PCR（MS-PCR）

DNA在亚硫酸氢盐作用后，DNA CpG若无甲基化，则序列中的C改变为U，若有甲基化则保持不变，因此从理论上讲，用不同的引物做PCR，即可检测出这种差异，从而确定基因有无CpG岛甲基化。因此根据目的基因修饰前后的改变，就可以相应设计M和U引物，有时我们需要设计两轮引物。

这种方法灵敏度高，无需特殊仪器，因此经济实用，是目前应用**为***的检测方法。不过也存在一定的局限性，预先需要知道待测片段的DNA序列，引物的设计非常重要。另外，亚硫酸氢盐处理也十分关键，若处理不完全则可能导致假阳性的出现。 重庆技术服务活动