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甲基化敏感性高分辨率熔解曲线分析(MS-HRM)

通过熔解曲线分析可以将单碱基序列的差异转变成熔解曲线的差异，因此DNA样本经过亚硫酸氢盐处理后，甲基化与未甲基化DNA会存在序列差异，这种差异可通过熔解曲线分析来发现。使用该方法进行甲基化分析*需一对引物，相对简单，不过这种方法对仪器的要求颇高，需要带HRM模块的荧光定量PCR仪，并且在进行实时定量PCR过程中，需要使用饱和的荧光染料。利用MS-HRM技术进行甲基化检测只能对检测片段整体甲基化情况进行分析，并不能明确每个CpG位点的甲基化状态。因此这种技术适用于大量样本的检测，筛选出感兴趣的CPG位点，然后利用其他方法进行单个位点的精确检测及甲基化程度的精确定量。 人类基因组有约56M的CpG位点，CpG岛约3万个。北京RIP-seq技术服务售后分析

    将待测DNA经过亚硫酸盐处理，通过PCR扩增过程引入T7启动子序列，经T7DNA聚合酶的体外转录过程得到各样本RNA产物，经碱基特异性酶切处理，得到RNA小片段，并用飞行质谱检测每个片段的分子量，***EpiTYPER程序完成数据的自动化处理并报告每个检测片段的甲基化程度。技术优势·检测片段长：扩增片段长度可达500bp·高灵敏度：可发现低至5%甲基化水平，样本起始量低至10ng。·重复性好：变异系数CV≤5%。·高性价比：用384孔板进行PCR反应，一个扩增产物可以进行多重CpG位点分析，无需后续验证，可直接用于文章发表。服务内容1.根据客户提供的序列信息进行预评估；2.进行样本DNA的分离、纯化、质检及亚硫酸盐修饰。3.使用特殊设计的一对引物扩增样本，得到带有T7RNA聚合酶启动子序列的扩增产物。4.在体外转录体系中，利用T7RNA聚合酶，将扩增产物转录为RN**断。5.利用RNaseA能够特异性识别并切割RNA中U3’端的特性，将RN**断切割成携带有CpG位点的小片断。6.使用sequenom®MassArray飞行质谱分析系统检测产物。由于同一片断中，只有CpG和CpA之间16Da的分子量差别，即质谱图中两者峰的差距。 北京RRBS技术服务方案焦磷酸测序技术服务基于QIAGEN公司的PyroMark Q96 ID平台。

    Agilent平台因为MeDIP技术本身的特点，都不能到达单碱基的分辨率，而Illumina的Infinium和GoldenGate检测技术却做得到。Illumina的Infinium甲基化检测技术来源与前期的SNP检测，采用的是单碱基延伸的原理。分析利用两个位点特异的探针检测这些序列差异的位点，一个探针是为甲基化位点(M磁珠类型)设计的，而另一个是为未甲基化位点(U磁珠类型)设计的。探针的单碱基延伸掺入了一个标记的ddNTP，它随后被荧光试剂染色。通过计算甲基化与未甲基化位点的荧光信号比例，可确定检测位点的甲基化水平。Illumina公司早期推出的InfiniumHumanMethylation27BeadChip芯片覆盖27,578个CpG位点。这款芯片在医学领域有***的应用，除了和**相关的甲基化筛选之外，也能用于其他疾病相关甲基化检测。因此对这款产品，研究者给予了很高的评价，目前此产品已停产，取而代之的是InfiniumHumanMethylation450BeadChip芯片。它以单碱基分辨率覆盖了基因组中超过45万个甲基化位点，实现了基因区域和CpG岛的***覆盖。此外，还包括CpG岛之外的CpG位点，在人类干细胞中鉴定出的非CpG甲基化位点，以及**和正常组织中差异表达的甲基化位点等等。它的高覆盖度、高通量以及低价格。

相比之下，VeraCode GoldenGate甲基化分析技术更适合中通量的筛选及验证研究，它以以矩阵微珠芯片(Sentrix Array Matrix(SAM)）形式分析48至384个用户指定的CpG位点。首先，将亚硫酸氢盐处理的基因组DNA 与分析oligo混合，oligo与未甲基化位点的U互补，或者与甲基化位点的C互补。杂交之后，引物延伸，并连接上位点特异的oligo来产生通用 PCR的模板。***，用标记的PCR引物生成可检测的产物。据Illumina的产品**介绍，其产品的**优势在于单个CpG位点的分辨率。其它分析将甲基化定位在一段区域，而通过Illumina分析，你能精确测定某个CpG位点的甲基化水平。ChIP-Seq 能实现真正的全基因组分析。

DNA甲基化作为表观遗传学研究的重要范畴，已经越来越受到研究者的关注。近些年来，随着DNA甲基化与组蛋白甲基化的联合作用机制、RNA干扰机制及去甲基化机制的发现，使得DNA甲基化研究受到***关注，从医学领域扩展到动植物研究当中，同时在研究方法上也取得了很大的突破。现在用于DNA甲基化检测的方法大概有十多种，从应用上来分，大致可以分成两类：全基因组甲基化分析及特异位点甲基化检测。下面，我们就这两大类检测技术进行分析比较，以便于在实际的科研工作中进行选择。云生物提供甲基化服务。850K芯片技术服务

5hmc是发现的一种修饰碱基，成为哺乳动物的“第六碱基”。北京RIP-seq技术服务售后分析

    简化基因组甲基化测序(ReducedRepresentationBisulfiteSequencing,RRBS)是通过限制性酶切的方法富集基因组DNA上富含CCGG位点的片段，经Bisulfite处理和高通量测序技术进行基因组CpG富集区域内的单碱基分辨率的甲基化测序。相对WGBS而言RRBS技术作为高性价比的甲基化测序方案，测序量大幅减少，在大规模临床样本研究中具有很不错的应用价值。技术优势从项目背景了解、协助方案设计、实验材料选取、建库测序，到数据分析，每个项目有特定的科学问题；需要专业、有价值的建议；科学、缜密的设计；及时高效的沟通；以保障高质量研究成果。信息分析基于简化基因组范围的甲基化分析，数据质控，5mCCalling，5mC在基因组、染色体、功能元件上的分布，多样本甲基化差异聚类，差异甲基化DMR鉴定及相关基因的功能分析，结合项目背景和科学问题的数据亮点挖掘。 北京RIP-seq技术服务售后分析