结果表明,PS亲和法可以检测到许多目前为止都无法检测的外泌体蛋白质和RNA。应用Tim4的外泌体强结合能力,可用ELISA或FACS高灵敏度定性检测、定量分析外泌体。以前无法用超速离心法提取的微囊泡,也通过运用PS亲和法实现高纯度提取。本指导书中对该技术进行详细说明,这项技术的有用性今后将受到世界各方评价,有望在外泌体和微囊泡生理功能的分析研究上起重大贡献。外泌体的检测和提取还遇到一个困难即:对各种外泌体的分类。研究人员尚未统一定义以何种方法提取的细胞外囊泡可以称之为外泌体,给实验数据的分析和重复性确认带来困难。近年,随着国际细胞外囊泡协会的成立、世界性研究者研讨会的举办,提案MISEV指南作为国际标准,计划或已经开始进行EV研究的科学家请务必阅读这些方针。随着今后的研究发展,外泌体功能逐步清晰,并扩大临床应用。江西胸水外泌体染色PKH67/PKH26
过细胞分泌到外泌体中的分子引起的。其中已发现外泌体内含有分泌细胞来源mRNA和miRNA,外泌体与细胞间遗传基因表达信息的水平传播相关性倍受瞩目。这些RNA被外泌体的脂质双层膜所保护,不会被核糖核酸酶所分解,可以在血液和体液中稳定存在。被靶细胞吞噬的外泌体通过与内体膜融合,将RNA释放到靶细胞的细胞质中。释放出来的mRNA翻译为蛋白质,但miRNA压制目的基因的翻译,因此外泌体在靶细胞内控制基因的表达。外泌体的蛋白质有数万种,mRNA、miRNA的种类有数千种以上,它们的结构除了受细胞来源不同的影响,还受到细胞状态不同的影响。江苏外泌体tmt通过临床数据分析显示外泌体整合素可作为预测肿细胞转移的部位倾向性的诊断指标。
全自动外泌体荧光检测分析系统能够对>50 nm的外泌体进行全方面的表征,无论是粒径尺寸、粒径分布还是外泌体的亚型均可在一次测试中得到。并且所用来测试的样本无需进行纯化,避免因纯化带来的样本偏差。分析不同大小和不同尺度的外泌体亚群,在CD171过表达系统中,100 nm以上的外泌体只表达了CD171。通过抗体捕获的模式,全自动外泌体荧光检测分析系统能够量化含有不同标记物的外泌体亚群,并对不同种群的外泌体进行特异性计数和分析。整个过程无需纯化,并且线性范围可跨越3个数量级。
l 亲脂染料标记外泌体:目前已发表的外泌体文章中,外泌体大多使用亲脂性染料进行标记,体内和体外都有较多应用。亲脂性染料主要分为两大类,一类是PKH67(绿色荧光)/PKH26(红色荧光),由于它们可以与外泌体的脂质双层膜稳定结合,所以染色效果较好,应用较普遍。第二类是Di系列的亲脂性染料,包括DiI(橙色荧光)、DiO(绿色荧光)、DiD(红色荧光)、DiR(深红色荧光)。其中DiR的红外荧光可穿透细胞和组织,在活成像中用来示踪。外泌体是内源性和质膜起源的不同类型的膜囊泡。
目前的主流观点认为,外泌体的产生过程为:细胞膜内陷,形成内体(endosome),再形成多泡体(multivesicular bodies,MVB),后分泌到胞外成为外泌体。外泌体中携带有母细胞的多种蛋白质、脂类、DNA和RNA等重要信息。外泌体早见于1981年,EG Trams 等在体外培养的绵羊红细胞上清液中发现了有膜结构的小囊泡,并命名为 exosome。对于外泌体的作用,当时推测为细胞排泄废物的一种方式。1996年G Raposo 等发现类似于B 淋巴细胞的免疫细胞也会分泌抗原呈递外泌体(antigen presenting vesicle),所分泌的外泌体可以直接刺激效应CD4+ 细胞的抗种瘤反应。2007 年H Valadi 等进一步发现细胞之间可以通过外泌体中RNA 交换遗传物质。随着有关外泌体研究越来越多,研究者发现它普遍参与了机体免疫应答、抗原呈递、细胞分化、种瘤生长于侵袭等各种生物过程中。在免疫系统中,据报道趋化因子受体CCR5通过外泌体在细胞之间转移是细胞人类免疫缺陷病毒传染的一种机制。江西胸水外泌体染色PKH67/PKH26
尚未完全发现调节外泌体细胞结合的途径。江西胸水外泌体染色PKH67/PKH26
目前,提取外泌体的方法主要有超速离心法、PEG沉淀法,但这些方法混有非常多的杂质,必须慎重分析得到的是否是外泌体。超速离心法存在操作繁杂、回收量不稳定,不能用于定量分析、必须使用昂贵的超速离心机、无法进行多样品分析等问题。因此外泌体研究相对困难,需要尽快开发操作简单、可提取高纯度外泌体的技术。因此,日本和光着眼于巨噬细胞的外泌体受体Tim4蛋白,制备Tim4细胞外域与磁珠结合的“Tim4磁珠”。Tim4通过磷酯酰丝氨酸(PS)法特异性结合Tim4蛋白和磁珠,再经过含有EDTA的洗脱缓冲液进行分离,提取高纯度的完整外泌体。江西胸水外泌体染色PKH67/PKH26