徐州实时Real-time PCR应用

聚合酶链反应：流聚合酶链反应:一种伪等温PCR方法。将溶液置于热梯度下，而不是反复加热和冷却聚合酶链反应混合物。由此产生的热不稳定性驱动对流流动自动将聚合酶链反应试剂从热区域和冷区域打乱，从而反复启动聚合酶链反应。通过利用混沌流场的出现，可以优化热边界条件和PCR外壳的几何形状等参数，以产生特异和快速的PCR。这种对流聚合酶链反应设置明显降低了设备功率需求和操作时间。逆转录聚合酶链反应(逆转录-聚合酶链反应):用于从RNA中扩增DNA。逆转录酶将核糖核酸逆转录成cDNA ，然后通过聚合酶链反应进行扩增。逆转录-聚合酶链反应较广用于表达谱，以确定基因的表达或鉴定RNA转录物的序列，包括转录起始和终止位点。如果基因的基因组DNA序列是已知的，逆转录-聚合酶链反应可以用来绘制基因中外显子和内含子的位置。基因的5’端(对应于转录起始位点)通常通过 RACE-PCR (快速扩增cDNA末端)中。聚合酶链式反应的模板的取材主要依据PCR的扩增对象，可以是病原体标本如病毒、细菌、菌类等。徐州实时Real-time PCR应用

聚合酶链式反应：模板的制备，PCR的模板可以是DNA，也可以是RNA。模板的取材主要依据PCR的扩增对象，可以是病原体标本如病毒、细菌、菌类等。也可以是病理生理标本如细胞、血液、羊水细胞等。法医学标本有血斑、精斑、毛发等。标本处理的基本要求是除去杂质，并部分纯化标本中的核酸。多数样品需要经过SDS和蛋白酶K处理。难以破碎的细菌，可用溶菌酶加EDTA处理。所得到的粗制DNA，经酚、氯仿抽提纯化，再用乙醇沉淀后用作PCR反应模板。徐州实时Real-time PCR应用聚合酶链式反应的引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70%。

PCR的反应条件：Tm=4（G+c）+（A+T），一般在45～55度，温度低容易退火但特异性低；温度高，不容易退火但特异性高。退火时间30秒。延伸温度一般在70～75度这时TaqDNA聚合酶活性很高（150个/S），当引物在16个碱基以下时可采用缓慢升高温度到70～75度的方法，使在低温下就开始合成。一般<1KB时间1分钟即可。当〈1KB时在较后的循环中延长扩增时间。循环次数25～30次。无产物时：取10ul扩增混合液作模板在进行PCR扩增；增加TaqDNA聚合酶浓度；增加循环次数；降低退火温度；加靶DNA量。

聚合酶链式反应的常见问题：阴性：需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：选定一个好的引物合成单位。引物的浓度不但要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。聚合酶链式反应中要确保反应缓冲液融化完全并彻底混匀。

聚合酶链式反应是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。工具/原料：扩增缓冲液，四种dNTP，引物，模板DNA，Taq DNA聚合酶， Mg离子，蒸馏水。模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。序列间特异性聚合酶链反应是一种用于DNA指纹识别的聚合酶链反应方法。苏州特殊样本荧光PCR应用

逆转录聚合酶链反应(逆转录-聚合酶链反应)：用于从RNA中扩增DNA。徐州实时Real-time PCR应用

聚合酶链式反应的常见问题：靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样内或溅出离心管外。除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进头等均应一次性使用。必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。徐州实时Real-time PCR应用