对于双光子（2P）成像而言，离焦和近表面荧光激发是两个比较大的深度限制因素，而对于三光子（3P）成像这两个问题大大减小，但是三光子成像由于荧光团的吸收截面比2P要小得多，所以需要更高数量级的脉冲能量才能获得与2P激发的相同强度的荧光信号。功能性3P显微镜比结构性3P显微镜的要求更高，它需要更快速的扫描，以便及时采样神经元活动；需要更高的脉冲能量，以便在每个像素停留时间内收集足够的信号。复杂的行为通常涉及到大型的大脑神经网络，该网络既具有局部的连接又具有远程的连接。要想将神经元活动与行为联系起来，需要同时监控非常庞大且分布普遍的神经元的活动，大脑中的神经网络会在几十毫秒内处理传入的刺激，要想了解这种快速的神经元动力学，就需要MPM具备对神经元进行快速成像的能力。快速MPM方法可分为单束扫描技术和多束扫描技术。多光子显微镜中，极短的激光脉冲聚焦在样品上的紧密点上，激发荧光团产生图像。美国飞秒激光多光子显微镜设备
现代分子生物学技术的迅速发展和科技的进步，特别是随着后基因组时代的到来，人们已经能够根据需要建立各种细胞模型，为在体研究基因表达规律、分子间的相互作用、细胞的增殖、细胞信号转导、诱导分化、细胞凋亡以及新的血管生成等提供了良好的生物学条件。然而，尽管人们利用现有的分子生物学方法，已经对基因表达和蛋白质之间的相互作用进行了深入、细致的研究，但仍然不能实现对蛋白质和基因活动的实时、动态监测。在细胞的生理过程中，基因、尤其是蛋白质的表达、修饰和相万作用往往发生可逆的、动态的变化。目前的分子生物学方法还不能捕获到蛋白质和基因的这些变化，但获取这些信息对与研究基因的表达和蛋白质之间的相互作用又至关重要。因此，发展能用于、动态、实时、连续监测蛋白质和基因活动的方法非常必要。美国模块化多光子显微镜成像区域多光子显微镜的发展现状及未来发展趋势。
对于双光子(2P)成像，散焦和近表面荧光激发是两个相对较大的深度限制因素，而对于三光子(3P)成像，这两个问题**减少。 然而，由于荧光团的吸收截面远小于2P，三光子成像需要更高的脉冲能量才能获得与2P相同激发强度的荧光信号。 功能性3P显微镜比结构性3P显微镜要求更高，后者需要更快的扫描速度以便及时采样神经元活动。 为了在每个像素的停留时间内收集足够的信号，需要更高的脉冲能量。 复杂的行为通常涉及大规模的大脑神经网络，这些网络既有本地连接，也有远程连接。 为了将神经元的活动与行为联系起来，需要同时监测* * *分布的超大型神经元的活动。 大脑中的神经网络将在几十毫秒内处理输入的刺激。 为了理解这种快速神经元动力学，MPM需要快速成像神经元的能力。 快速MPM方法可分为单束扫描技术和多束扫描技术。
细胞在受到外界刺激时，随着刺激时间的增长，即使刺激继续存在，Ca2+荧光信号不但不会继续增强，反而会减弱，直至恢复到未加刺激物时的水平。对于细胞受精过程中Ca2+荧光信号的变化情况，研究发现，配了在粘着过程中，Ca2+荧光信号未发生任何变化，而配子之间发生融合作用时，Ca2+荧光信号强度却会出现一个不稳定的峰值，并可持续几分钟。这些现象，对研究受精发育的早期信号及Ca2+在卵细胞和受精卵的发育过程中的作用具有重要的意义。在其它一些生理过程如细胞分裂、胞吐作用等，Ca2+荧光信号强度也会发生很的变化。多光子显微镜技术的优势如何？又有哪些应用？
光学成像技术与分子生物学技术的结合为研究上述科学问题提供了条件与可能。因此，在现代分子生物学技术基础上，急需发展新的成像技术。在动物体内，如何实现基因表达及蛋白质之间相五作用的实时在体成像监测是当前迫切需要解决的重大科学技术问题。这是也生物学、信息科学（光学）和基础临床医学等学科共同感兴趣的重大问题。对这-一一科学问题的研究不仅有助于阐明生命活动的基本规律、认识疾病的发展规律，而且对创新药物研究、药物疗效评价以及发展疾病早期诊断技术等产生重大影响。全球多光子显微镜主要厂商基本情况介绍，包括公司简介、多光子显微镜产品型号、产量、产值及动态等。布鲁克多光子显微镜三维分辨率
多光子显微镜已经被生物学家普遍的运用于实验中。美国飞秒激光多光子显微镜设备
当激光光束焦点的位置在镜面上，此时被反射的激光在无限空间中成为准直光束，并在OBJ2的焦平面上形成了一个激光光斑。同理，如果横向扫描光束，则会形成远离倾斜镜镜面的焦点，这又导致返回的光束会聚或发散，进而OBJ2能在轴向不同位置形成焦点，通过这种方式即能实现连续的轴向扫描。对于较小的倾斜角，聚焦没有球差。该组在实验中表征了这种将横向扫描转换为轴向扫描技术的光学性能，并使用它将光片显微镜的成像速度提升了一个数量级，从而可以在三个维度上量化快速的囊泡动力学。该组还演示了使用双光子光栅扫描显微镜以12 kHz进行共振远程聚焦，该技术可对大脑组织和斑马鱼心脏动力学进行快速成像，并具有衍射极限的分辨率。美国飞秒激光多光子显微镜设备
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