双光子之源：飞秒激光：双光子吸收理论早在1931年就由诺奖得主MariaGoeppertMayer提出，30年后因为有了激光才得到实验验证，但是到WinfriedDenk发明双光子显微镜又用了将近30年。要理解双光子的技术挑战和飞秒激光发挥的重要作用，首先要了解其中的非线性过程。双光子吸收相当于和频产生非线性过程，这要求极高的电场强度，而电场取决于聚焦光斑大小和激光脉宽。聚焦光斑越小，脉宽越窄，双光子吸收效率越高。对于衍射极限显微镜，聚焦在样品上的光斑大小只和物镜NA和激光波长有关，所以关键变量只剩下激光脉宽。基于以上分析，能够以高重频(100MHz)输出超短脉冲(100fs量级)的飞秒激光器成了双光子显微镜的标准激发光源。这也再次说明双光子显微镜的优势：只有焦平面处才能形成双光子吸收，而焦平面之外由于光强低无法被激发，所以双光子成像更清晰。WinfriedDenk初使用的光源是染料飞秒激光器(100fs脉宽、630nm可见光波长)。虽然染料激光器对于实验室演示尚可，但是使用很不方便所以远未实现商用。很快双光子显微镜的标配光源就变成了飞秒钛宝石激光器。除了固态光源优势，钛宝石激光器还具有较宽的近红外波长调谐范围，而近红外相比可见光穿透更深，对生物样品损伤更小。双光子显微镜有哪些分类呢？布鲁克双光子显微镜商家电话
在该自适应光学双光子荧光显微镜中，她们将空间光位相调制器光学共轭到显微物镜的后焦平面，通过位相调制器将入射光分成若干子区域，每一块子区域的波前都可以被控制。同时，她们用数字微阵列光处理器，以不同的频率同时调制其中一半子区域的入射光强度，以另一半子区域作为“参考波前”。来自所有子区域光束会在焦点处会聚干涉，通过监测焦点激发的双光子信号随时间的变化情况，并进行傅里叶变换分析，可以“分解”得到被调制的每一块子区域的“光线”的贡献信息，从而可以实现对一半子区域波前的并行测量。对另一半子区域重复这一测量过程，从而获得整个入射波前的信息并进行校正。该方法耗时很短，通常约1~3分钟左右即可完成像差的测量和校正，无需复杂的计算，适用于任何标记密度和标记类型的样品。更重要的是，得到的像差校正图案可以用于提高较大视场范围内的成像质量。该方法无疑为在体研究小鼠大脑皮层深层区域的生物、医学问题提供了可行性方案。2PPLUS双光子显微镜光损伤双光子显微镜已成为较厚有生命体生物组织三维成像中不可或缺的工具。
第二代微型化双光子荧光显微镜 FHIRM-TPM 2.0，其成像视野是该团队于2017年发布的代微型化显微镜的7.8倍，同时具备三维成像能力，获取了小鼠在自由运动行为中大脑三维区域内上千个神经元清晰稳定的动态功能图像，并且实现了针对同一批神经元长达一个月的追踪记录。在一批“早鸟项目”中，该系统已被多个研究组应用于不同的模式动物和行为范式，如小鼠的社交新颖性识别、斑胸草雀受调控后大脑特定神经元变化、新型神经递质乙酰胆碱探针的传导适应性分析以及猕猴三脑区成像等多项研究。
在国家自然科学基金委国家重大科研仪器研制专项《超高时空分辨微型化双光子在体显微成像系统》的支持下，北京大学分子医学研究所、信息科学技术学院、动态成像中心、生命科学学院、工学院联合中国人民医学科学院组成跨学科团队，历经三年多的协同奋战，成功研制新一代高速分辨微型化双光子荧光显微镜，并获取了小鼠在自由行为过程中大脑神经元和神经突触活动清晰、稳定的图像。原始论文于5月29日在线发表于自然杂志子刊Nature Methods (IF 25.3)，相关技术文档同步发表于Protocol Exchange (DOI: 10.1038/protex.2017.048)，并已申请多项。如果已经有了飞秒光，就可以几套双光子显微镜共享一台，只需分光即可。
从双光子到三光子：科学家正在从双光子转向三光子显微镜。1996年，ChrisXu在康奈尔大学(Denk同导师实验室)读博期间发明了三光子显微镜，如果双光子吸收可行，那么三光子看起来也是自然的发展方向。三光子成像使用更长的波长，大约在1.3和1.7微米，其成像深度也比双光子更深，目前记录约为2.2毫米，人类大脑皮层厚约4毫米。相比双光子显微镜，三光子还要求以较低重频使用更强和更短的激光脉冲，而传统的钛宝石激光器难以达到这些要求，但是对于掺镱光纤飞秒光参量放大器则非常容易，比如我们的Y-Fi光参量放大器(OPA)。双光子显微镜在组织透明化成像中应用；美国双光子显微镜光子探测
双光子显微镜能够进行指标成像；布鲁克双光子显微镜商家电话
Denk很快就将双光子显微镜用于神经元成像，而1997年在Svoboda测量完整老鼠大脑的锥体神经元的感官刺激诱导树突钙离子动态后，双光子显微镜的潜能开始完全凸显。值得一提的是，霍华德·休斯医学院Svoboda实验室和Thorlabs在2016年合作推出了一种强大的多光子介观显微镜，其成像视场达到5毫米，能够跨多个脑区进行高速功能成像。根据清华大学单一采购来源的**指导意见：这种显微镜的视场是普通双光子显微镜的10倍。30年来，双光子显微镜已成为较厚生物组织三维成像中不可或缺的工具。从双光子到三光子甚至四光子，这种非线性成像技术通常也被统称为多光子显微镜。下图统计了自1990年以来每年发表的多光子显微镜文章数量，发展速度可见一斑。布鲁克双光子显微镜商家电话
