珠三角相对定量qPCR仪应用

了解了荧光阈值的概念后，Ct 值就很好理解了。C Cycle，t threshold，所谓 Ct 值就是在荧光 PCR 扩增过程中，当扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。如上文中图所示，黑色的线显示的是荧光阈值，当信号超过黑色线时所经历的循环数即为 Ct 值。从这也可以了解到 Ct 值是可以变化的，我们实验时带有一定的人为因素。而荧光定量 PCR 后面的数据处理要用到 Ct 值来计算，所以有关荧光阈值的设置就显得尤为重要。一般说来，新手按荧光 PCR仪的自动设置为好，而如果你非常有经验，一般会手动设置荧光阈值。因为 Ct值即达到荧光阈值所经过的循环数，所以它就与模版的拷贝数存在着线性关系，起始拷贝数越多，经过的循环数就越少， Ct 值也就越小，反之亦然。正常的 CT值范围在 18-30 之间，过大和过小都将影响实验数据的精度。前面也提到过，同一模板经过 96 次 PCR 扩增，扩增产物虽然不恒定，但Ct 值极具重现性。根据这个特点，我们可以利用已知起始拷贝数的标准样品的。Ct 值做出标准曲线，只要在同一次 PCR 实验中得到未知样品的 Ct 值，就可以根据曲线算出该未知样品的起始拷贝数。利用外标准曲线的实时荧光定量PCR是迄今为止定量准确，重现性比较好的定量方法，已得到全世界的公认。珠三角相对定量qPCR仪应用

实时荧光定量PCR（QPCR）：一般用于检测样品中目的基因的表达量。比如：在实验过程中，构建了目的基因的过表达载体，转染进细胞后，实验中需要在转录水平和蛋白水平检测目的基因的表达，转录水平就需要用到QPCR，蛋白水平就是WB。也可用于检测基因组DNA中目的基因的拷贝数。主要步骤：从细胞/血液/组织中提取RNA，检测RNA纯度-去除基因组DNA-逆转录成cDNA-配置QPCR预混液-QPCR96孔板排版加样，3个复孔-上机QPCR仪器检测-据CT值分析实验结果。根据荧光类型主要分为荧光嵌合法（又称为染料法）和荧光探针法。 珠三角相对定量qPCR仪应用经荧光定量PCR仪器检测后，对核酸进行定性和定量分析。

阴性对照一般是指用水代替模板的反应孔，体系中除了模板，包括了其他的反应组分。由于qPCR的高灵敏性，阴性对照有出现扩增信号的情况，那么在针对这类问题时，我们需要判断其原因所在。使用染料法进行qPCR实验时，首先查看阴性对照的溶解曲线主峰是否跟阳性孔的主峰位置一致。如果一致，要看两者Cq相差多少，比如，针对某一种引物的实验样品Cq值为28. 5，阴性对照的Cq值为33. 6，由于Cq值相差大于5，如果按95%的扩增效率计算，两者模板量相差28倍之多，对分析数据影响不大，所以实验样品的Cq值还是可以采用的；但是，如果两者的Cq值相差 1~2，这说明阴性对照中有较大的模板污染，则需要考虑更换试剂或引物，分区加样，重新实验。如果不一致，阴性对照主峰对应的Tm值小于阳性孔的Tm值，则可能是引物性能不好，无模板或使用低浓度模板下会出现引物二聚体，这种情况则需要考虑更换引物，保证引物特异性以及扩增效率。

染色质片段化——DN段化:细胞核材料片段化是获得良好的ChIP 分辨率的关键因素，理想情况下的片段大小在 200 到 800 bp对之间。剪切是难控制的步骤之一。通过超声处理和/或核酸酶/酶促消化可以实现剪切，各有利弊。超声处理需要大量的手动操作时间，但非常适合难以裂解的细胞；酶促消化不需要手动操作，适用于大量样品的处理，但其剪切位点不是随机的。两种方法都需要根据具体细胞系进行优化。注意：此时可以停止ChIP。经过剪切/消化染色质后，可以将样品于-80°C储存。避免反复冻融。qPCR面对小的差异较弱，dPCR则可识别差异较小的拷贝数。

实时荧光定量PCR技术有效地解决了传统定量只能终点检测的局限，实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度，并记录在电脑软件之中，通过对每个样品Ct值的计算，根据标准曲线获得定量结果。因此，实时荧光定量PCR无需内标是建立在两个基础之上的：1）Ct值的重现性PCR循环在到达Ct值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期（对数期），此时微小误差尚未放大，因此Ct值的重现性极好，即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增，得到的Ct值是恒定的。2）Ct值与起始模板的线性关系由于Ct值与起始模板的对数存在线性关系，可利用标准曲线对未知样品进行定量测定，因此，实时荧光定量PCR是一种采用外标准曲线定量的方法。外标准曲线的定量方法相比内标法是一种准确的、值得信赖的科学方法。利用外标准曲线的实时荧光定量PCR是迄今为止定量准确，重现性比较好的定量方法，已得到全世界的公认，范围广用于基因表达研究、转基因研究，药物疗效考核、病原体检测等诸多领域。实时荧光定量PCR 是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应循环后产物总量的方法。广州Quantagene q225mxqPCR仪采购

qPCR通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。珠三角相对定量qPCR仪应用

检测原理：将一个样本分成几十到几万份，再将其分配到不同的反应单元中，使每个微滴单元包含一个或多个拷贝的核酸分子（即DNA模板），每个单元都会对目标分子进行扩增，检测PCR扩增产物的荧光信号强度，带入泊松分布即可计算出起始模板DNA浓度。dPCR原理:微滴式数字PCR检测流程：其方法与qPCR类似，分为以下几步。:1、DNA提取2、DNA浓度检测并稀释。3、配置PCR反应液。4、上机到PCR仪中进行检测。5、PCR扩增。6、结果判读。使用微滴数字PCR仪逐个对每个微滴进行检测，有荧光信号的微滴判读为1，没有荧光信号的微滴判读为0，终根据泊松分布原理以及阳性微滴的比例，计算出DNA浓度。

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