华南地区节省qPCR仪使用说明

所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。实时荧光定量PCR （Quantitative Real-time PCR）是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。·Real-timePCR是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。qPCR 反应所需时间取决于反应溶液进行变温所需要的时间，这过程受到加热块升降温速度和液体升降温速度影响。华南地区节省qPCR仪使用说明

Quantagene q225 系列荧光定量PCR 43分钟完成实验，再加3分钟做完熔解曲线需43分钟即可完成一个40循环的常规qpcr实验。DNA熔解曲线的检测快可在3分钟内完成。使用快速试剂，30个热循环的检测更可缩短至20分钟。精密设计的加热块和孔板q225的加热块经过精密设计，能够很大程度地贴合孔板形状，实现高效的热传导，使得在加热块达到预定温度后反应溶液也能在短时间内达到相同温度，反应溶液温度更为均一。快速循环，稳定温度 q225 出色的热循环系统设计使得40 个循环的常规 qPCR 可以在短短43 分钟内轻松完成，让您的工作效率获得质的提升。整个实验过程中温度稳定，不受实验时间延长而导致的机器内部背景温度上升的影响。华南地区准确qPCR仪应用qPCR通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。

定量方法包括相对定量和定量，两者的重要差异在于相对定量的结果是差异性的结果，涉及比较；而定量的结果是一个具体数值，对于基因表达量而言是基因的拷贝数，不涉及任何比较。相对定量首先需要确定一个内参基因，内参基因作用有检测样本材料中RNA是否降解、纠正样本加样的差异、校正cDNA合成速率差异及校正PCR抑制剂的影响，其本质作用是利用内参基因的Ct值对目的基因的Ct值进行均一化处理，常用的内参基因包括DH、β-actin、18S rRNA，使用的时候需要注意其序列必须是物种本身的特异序列，虽然其比较保守，但不同物种也会存在碱基差别。另外，相对定量需要确定参照物，因为涉及比较，参照物选择不同，所得的定量结果可能完全相反，经常选择的参照物一般是对照组或未处理组。

实时荧光定量PCR（QPCR）：一般用于检测样品中目的基因的表达量。比如：在实验过程中，构建了目的基因的过表达载体，转染进细胞后，实验中需要在转录水平和蛋白水平检测目的基因的表达，转录水平就需要用到QPCR，蛋白水平就是WB。也可用于检测基因组DNA中目的基因的拷贝数。主要步骤：从细胞/血液/组织中提取RNA，检测RNA纯度-去除基因组DNA-逆转录成cDNA-配置QPCR预混液-QPCR96孔板排版加样，3个复孔-上机QPCR仪器检测-据CT值分析实验结果。根据荧光类型主要分为荧光嵌合法（又称为染料法）和荧光探针法。 q225 出色的热循环系统设计使得40 个循环的常规 qPCR 可以在短短43 分钟内轻松完成，让您的工作效率获得质提升 。

合成引物时需注意：在设计PCR引物时，首先确定要扩增的DNA区域，并设计一对专门位于目标区域的引物，一个在正向链上，另一个在反向链上。引物须具有特异性，避免扩增出非特异性片段。正向引物与反向引物应具有相似的退火温度，GC含量与退火温度相关，调整引物长度可以改变退火温度。避免引物序列有二级结构或引物二聚体，会降低PCR效率。许多的在线工具可用于辅助引物设计。PCR扩增包括三组被设定好的时间和温度，步骤为：变性，退火和延伸1、变性：PCR的第一步称为变性，将模板DNA加热到95°C几秒钟，将两条DNA链分开，使它们之间的氢键迅速断裂。2、退火：反应混合物冷却30秒至1分钟。退火温度通常为50-65°C，但确切的比较好温度取决于引物的长度和顺序。不同的引物可能具有不同的退火温度。3、延伸：温度升至混合物中存在的DNA聚合酶的理想工作温度，通常约为72°C。DNA聚合酶附着在每个引物的一端，并合成与模板DNA互补的DNA新链。qPCR荧光标记法分为SYBR Green I染料法为主的荧光染料嵌合法，以Taqman探针法为主的荧光探针法.上海荧光定量qPCR仪使用说明

qPCR面对小的差异较弱，dPCR则可识别差异较小的拷贝数。华南地区节省qPCR仪使用说明

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