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检测复杂的生物学结构需要较高清晰度的荧光信号,并将荧光信号从背景噪声中分离开来。标准的免疫荧光标记很少能够获得较佳信噪比的成像效果。获得良好图片和较佳的可供发表的高质量图像之间的差异就在于:需要精细调整样品信号达到峰值特异性、高清晰度和较佳放大倍数。虽然荧光基团是进行高质量细胞成像的较佳选择,但不可避免地也极易发生光漂白,即荧光信号的光化学降解或衰退。任何光敏感度的下降都可能导致数据出现偏差,产生假性结果。抗淬灭封片剂可以保护荧光标记蛋白的稳定性,维持数周乃至数月的图像信号完整度。免疫荧光技术是一种以荧光素标记抗体来定位抗原物质的高度发达的标记免疫技术。P21免疫检测

P21免疫检测,免疫

免疫荧光间接法:如检查未知抗原,先用已知未标记的特异抗体(一抗体)与抗原标本进行反应,用水洗去未反应的抗体,再用标记的抗抗体(第二抗体)与抗原标本反应,使之形成抗体—抗原—抗体复合物,再用水洗去未反应的标记抗体,干燥、封片后镜检。如果检查未知抗体,则表明抗原标本是已知的,待检血清为一抗体,其它步骤的抗原检查相同。标记的抗抗体是抗球蛋白抗体,同于血清球蛋白有种的特异性,如免疫抗鸡血清球蛋白只对鸡的球蛋白发生反应,因此,制备标记抗体适用于任何抗原的诊断。CD8免疫荧光抗体技术可以用于检测和定位细胞或组织中的特定抗原物质。

P21免疫检测,免疫

细胞的固定及免疫荧光:吸去一抗,使用PBS浸洗 3 次,每次 5 min。向孔内滴加足够量适宜浓度的二抗,37℃,室温避光孵育1小时。注意二抗带有荧光素标记,因此操作过程尽量在暗处进行。吸去二抗,使用PBS浸洗 3 次,每次 5 min。向玻片上滴加DAPI,或者Hoechst复染细胞核,一般为蓝色荧光;避光孵育5-10min。使用PBS轻洗细胞3 次,每次 5 min,洗去多余的DAPI。取爬片时由于爬片与培养皿底结合较紧,张力较大,可将注射器针头针尖向背面做个小钩,这样将爬片轻轻勾起,用小镊子取出即可。用吸水纸吸干爬片上的液体,用含抗荧光淬灭剂的封片液封片,注意将爬片反过来贴于多聚赖氨酸载玻片上,然后在荧光显微镜下观察并采集图像,注意选择抗体对应的激发光源。

免疫荧光通过抗体与示踪物质结合,利用抗原-抗体结合反应,进而对抗原所在的细胞或组织进行定性或定量。由于荧光素所发的荧光可在荧光显微镜下检出,荧光素受激发光的照射而发出明亮的荧光,可以看见荧光所在的细胞或组织,利用定量技术测定含量,从而可对抗原进行细胞定性和定位分析。细胞免疫荧光用途:快速直观显示所检测蛋白的细胞定位。材料与仪器:样品:贴壁细胞;试剂:4% 组织固定液,PBS,Triton X-100,BSA,荧光二抗,免疫荧光染色二抗稀释液,抗荧光猝灭封片液,0.25% 胰酶;器材:6/12/24 孔板,细胞爬片(盖玻片),载玻片,15 ml 离心管。免疫荧光技术可以用于研究免疫系统的功能和异常。

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zo-1的免疫荧光,步骤如下:1.细胞在盖片上生长融合到95%-100%时,从孵箱中取出。2.用预温的1×PBS洗3次,每次10分钟。3.4%的甲醛室温固定20-30分钟。4.1×PBS洗3次,每次10分钟。5.0.2%TritonX-100透化2-5分钟。6.1×PBS洗3次,每次10分钟。7.5%BSA室温封闭30分钟。8.加一抗(用1%BSA稀释)放在湿盒里,4度过夜。9.1×PBS洗3次,每次10分钟。10.加二抗(用1%BSA稀释)30分钟,闭光。11.1×PBS洗3次,每次10分钟。12.95%甘油封片。注:4%甲醛,0.2%Triton,5%BSA均用1×PBS稀释。免疫荧光在医学诊断中起着重要作用,可以用于检测病原体、肉瘤标志物等。MMP13免疫荧光IF

免疫荧光细胞化学技术用于显示和检查细胞或组织内的抗原或半抗原物质。P21免疫检测

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