细胞免疫荧光主要用于蛋白定位研究和细胞内信号转导,细胞免疫荧光技术是利用免疫技术和荧光标记技术相结合,原理就是利用抗原-抗体反应之后,采用荧光标记,标记完成后,显微镜下观察细胞内某种抗原成分的多少,从而做出一个定位研究,也可以为细胞内信号传导提供一个明确的指导,细胞免疫荧光具有敏感性强、特异性高、速度快的特点,是目前比较常用的组织学技术,也是比较精确的。免疫荧光染色的主要原理是利用抗原抗体之间的特异性结合来显示目的蛋白,主要包括蛋白和一抗结合,其次是带有荧光基团的二抗识别并结合一抗,荧光显微镜下即可观察到荧光。免疫荧光技术可以用于研究植物病理学和农业生产。MAP2免疫荧光IF
免疫荧光间接法:如检查未知抗原,先用已知未标记的特异抗体(一抗体)与抗原标本进行反应,用水洗去未反应的抗体,再用标记的抗抗体(第二抗体)与抗原标本反应,使之形成抗体—抗原—抗体复合物,再用水洗去未反应的标记抗体,干燥、封片后镜检。如果检查未知抗体,则表明抗原标本是已知的,待检血清为一抗体,其它步骤的抗原检查相同。标记的抗抗体是抗球蛋白抗体,同于血清球蛋白有种的特异性,如免疫抗鸡血清球蛋白只对鸡的球蛋白发生反应,因此,制备标记抗体适用于任何抗原的诊断。MAP2免疫荧光IF免疫荧光技术可以用于研究细胞内蛋白质的定位和表达水平。
免疫荧光应用范围:其应用范围极其普遍,可以测定内分泌、蛋白质、细胞因子、细胞表面抗原、多肽、核酸、受体、神经递质、肉瘤标志物、血药浓度等各种生物活性物质。根据诊断类别,又可分为传染性疾病、内分泌、药物检测、免疫学、血型鉴定等。免疫荧光实验步骤:洗涤:PBS洗涤5min*3次。封闭:使用封闭液对样本进行封闭,一般1h。加一抗:使用合适浓度的一抗与样本4℃过夜。洗涤:PBS或PBST洗涤5min*3次。加二抗:使用间接法时需要加二抗处理,根据说明书使用合适的浓度,避光处理1h(后面步骤均需避光)。洗涤:PBS或PBST洗涤5min*3次。封片:滴一滴防淬灭剂,封片。可立即观察后暂存4℃尽快观察。
免疫荧光注意事项:对照实验的设置:1、内源性组织背景对照:某些细胞和组织可能有固有的生物学性质,会产生背景荧光,对结果产生影响,例如色素脂褐质。因此在孵育一抗前,应对样品进行观察,确保抗原本身没有信号。2、阳性对照:用确认含有待测抗原的组织或细胞,与待测标本进行统一处理,结果应为阳性,可证明待测抗原有一定活性并且实验过程中用的试剂及方法均可靠。3、阴性对照:与阳性对照相反,用明确不含有待测抗原的细胞或组织切片染色,结果若为阴性,可排除染色过程中由于非特异性染色造成的假阳性结果。免疫荧光技术可以用于研究细胞凋亡和细胞存活。
细胞免疫荧光实验注意事项:非特异性染色:是否灭活内源性过氧化物酶;孵育过程中干片;抗原热修复过度。染色过深:一抗浓度过高;染色试浓度过高或孵育时间过长;染色剂浓度过高或孵育时间过长。通常实验室先固定细胞再进行通透,但若检测抗原是水不溶性蛋白,可先通透再固定,这样可以通过通透去除一些水溶性蛋白,进而可降低免疫荧光背景和非特异性信号;建议设阴性对照组,消除由于抗体非特异性结合而产生的背景染色;选择醛类固定液时,保持其新鲜度,较好现配现用,使用不新鲜的醛类固定液自发荧光背景会升高。免疫荧光技术可以通过荧光信号显示和检查细胞或组织内的抗原或半抗原物质。MAP2免疫荧光IF
免疫荧光技术可以用于研究细胞凋亡、细胞增殖和细胞分化等生物学过程。MAP2免疫荧光IF
免疫荧光实验的注意事项:对荧光标记的抗体的稀释,要保证抗体的蛋白有一定的浓度,一般稀释度不应超过1:20,抗体浓度过低,会导致产生的荧光过弱,影响结果的观察。染色的温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化,染色时间可以从10min到数小时,一般30min已足够。染色温度多采用室温(25℃左右),高于37℃可加强染色效果,但对不耐热的抗原(如流行性乙型脑炎病毒)可采用0-2℃的低温,延长染色时间。低温染色过夜较37℃30min效果好的多。MAP2免疫荧光IF
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在心血管组织工程中,构建具有功能的心血管组织需要多种细胞类型的参与,如内皮细胞、平滑肌细胞等,并且细胞之间的相互作用以及细胞与细胞外基质的关系至关重要。利用多重免疫荧光,我们可以用不同颜色标记内皮细胞、平滑肌细胞以及细胞外基质成分。例如,用绿色荧光标记内皮细胞的标志物,如血管内皮生长因子受体-2(VEGFR-2);红色荧光标记平滑肌细胞的标志物,如α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA);蓝色荧光标记细胞外基质中的胶原蛋白。这样就能在构建的心血管组织模型中观察到内皮细胞和平滑肌细胞的分布、排列情况,以及它们与细胞外基质的相互作用。在研究心血管组织工程植入体的整合过程中,多色免疫荧光同样发挥着作用。我们...