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荧光的产生:一此化学物质能从外界吸收并储存能量(如光能、化学能等)而进入激发态,当其从激发态再回复到基态时,过剩的能量可以电磁辐射的形式放射(即发光)。荧光发射的特点是:可产生荧光的分子或原子在接受能量后即刻引起发光;而一旦停止供能,发光(荧光)现象也随之在瞬间内消失。可以引起发荧光的能量种类很多,由光激发所引起的荧光称为致荧光。由化学应所引起的称为化学荧光,由X线或阴极射线引起的分别称为X线荧光或阴极射线荧光。荧光免疫技术一般应用致荧光物质进行标记。免疫荧光技术可以用于研究细胞内蛋白质的定位和表达水平。GLUT4免疫

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免疫荧光实验的注意事项:为了保证荧光染色的正确性,初次试验时需设置下述对照,以排除某些非特异性荧光染色的干扰。①标本自发荧光对照:标本加1-2滴0.01mol/L,pH7.4的PBS。②特异性对照(抑制试验):标本加未标记的特异性抗体,再加荧光标记的特异性抗体。③阳性对照:已知的阳性标本加荧光标记的特异性抗体。如果标本自发荧光对照和特异性对照呈无荧光或弱荧光,阳性对照和待检标本呈强荧光,则为特异性阳性染色。一般标本在高压汞灯下照射超过3min,就有荧光减弱现象,经荧光染色的标本较好在当天观察,随着时间的延长,荧光强度会逐渐下降。CD8免疫荧光试验荧光抗体技术可以用于检测和定位细胞或组织中的特定抗原物质。

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zo-1的免疫荧光,步骤如下:1.细胞在盖片上生长融合到95%-100%时,从孵箱中取出。2.用预温的1×PBS洗3次,每次10分钟。3.4%的甲醛室温固定20-30分钟。4.1×PBS洗3次,每次10分钟。5.0.2%TritonX-100透化2-5分钟。6.1×PBS洗3次,每次10分钟。7.5%BSA室温封闭30分钟。8.加一抗(用1%BSA稀释)放在湿盒里,4度过夜。9.1×PBS洗3次,每次10分钟。10.加二抗(用1%BSA稀释)30分钟,闭光。11.1×PBS洗3次,每次10分钟。12.95%甘油封片。注:4%甲醛,0.2%Triton,5%BSA均用1×PBS稀释。

荧光的猝灭:荧光分子的辐射能力在受到激发光较长时间的照射后会减弱甚至猝灭,这是由于激发态分子的电子不能回复到基态,所吸收的能量无法以荧光的形式发射。一些化合物有天然的荧光猝灭作用而被用作猝灭剂,以消除不需用的荧光。因此荧光物质的保存应注意避免光(特别是紫外光)的直接照射和与其他化合物的接触。在荧光抗体技术中常用一些非荧的色素物质如亚甲蓝、碱性复红。伊文思蓝或低浓度的过锰酸钾、碘溶液等对标本进行得当复染,以减弱非特异性荧光本质,使特异荧光更突出显示。免疫荧光技术是一种利用荧光物质标记抗体来定位抗原的技术。

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注意:从加荧光二抗起,后面所有操作步骤都尽量在较暗处进行.DAPI复染核:爬片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次,每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加DAPI染液,避光室温孵育10min。封片:爬片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次,每次5min。玻片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。镜检拍照:切片于荧光显微镜下观察并采集图像。(DAPI紫外激发波长330-380nm,发射波长420nm,发蓝光;FITC激发波长465-495nm,发射波长515-555nm,发绿光;CY3激发波长510-560,发射波长590nm,发红光)。两种抗体同时孵育:由于FIT容易萃灭,因此在孵育抗体时后孵育FITC二抗(孵育二抗一定要避光。免疫荧光细胞化学技术用于显示和检查细胞或组织内的抗原或半抗原物质。GFAP免疫荧光试验

免疫荧光技术在免疫学研究中发挥重要作用,帮助揭示细胞和分子的功能和相互关系。GLUT4免疫

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