CD68免疫荧光试验

细胞免疫荧光可以观察蛋白在细胞中的定位，以及一些特殊信号分子蛋白的出核/入核的定位变化。在进行细胞免疫荧光过程中，需要用到细胞爬片，通过将爬片浸在细胞培养基内，细胞在爬片上生长，进而进行细胞的免疫荧光。实验前准备：1.胰酶;2.DMEM细胞培养基;3.细胞培养12孔板或者6孔板;4.爬片。间接免疫荧光的优点：通过增加能够与一抗结合的二抗数量进行信号放大；与直接免疫荧光相比，通过信号放大提高检测灵敏度。免疫荧光技术是一种以荧光素标记抗体来定位抗原物质的高度发达的标记免疫技术。免疫荧光技术是一种利用荧光物质标记抗体来定位抗原的技术。CD68免疫荧光试验

细胞免疫荧光简单实验步骤如下：1. 漂洗血清蛋白H7、2-7、4 37度 PBS 2小时。2. -20度甲醇固定20分钟后,自然、干燥 10分钟。3. PBS洗净：3min×3。4. 1%Triton：25 min~30 min、配成50 ultriton+5 mlpBS。5. PBS洗净：2×5 min。6. 羊血清封闭：37度，20分钟。7. 一抗，4度过夜，一般要大于18小时或者37度，1-2小时。8. 4度PBS洗净，3 min×5次。9. 二抗37度小于一小时。10. 37度 PBS洗净，3×5 min。11. 凉干封片（封闭液PH8.5）；不管采用何种方法，在使用PBS缓冲液漂洗时，都要漂洗干净并且要测下pH值，可以使用PBS多清洗几次，也可以延长PBS清洗时间，如果结果背景较高可以延长漂洗的次数和时。CD68免疫荧光试验荧光抗体法和荧光抗原法都属于免疫荧光技术的范畴。

细胞免疫荧光步骤是什么呢？步骤：1. 细胞一定要贴在玻片上（较好可以放入24孔板），为后面照像打基础。细胞密度适中，大约60-75%满片即可，否则容易脱片。2. 取出细胞后用4%多聚甲醛固定15分钟，现用现配。（以下各步骤切毋使玻片干燥）3. PBS冲洗；4. 0.1%Triton作用20分钟；5. PBS冲洗；6. 10%正常血清封闭10分钟；7. 加入一抗，4度孵育过夜（找个小瓶盖将小玻片支起来，抗体就不容易溢出），还要记住“砸片”，就是抗体从较高处落到片子上，以分布均匀。抗体稀释度1：60，较常用！8. PBS冲洗4次，各5分钟；9加入荧光二抗，室温30分钟。抗体稀释度1：400，较常用！10. 90%甘油封片。也很关键阿，多封几次才有体会。12. 避光保存，或到显微镜下观察。

免疫荧光的原理和类型：免疫荧光利用荧光分子或荧光团在一定波长（分子的吸收光谱）下吸收光子的特性，经过短暂的间隔（发射光谱）后以较高的波长发射光子，并伴随能量损失。发射的荧光可通过显微镜观察到。荧光团可以通过可见光或紫外光激发。具有高光稳定性和荧光量子产率的荧光染料可在市场上购买，其激发较大值跨越从400到>700nm的波长范围。它们不会损伤活细胞，可安全用于生物制剂。在进行免疫荧光检测时，首先对细胞或组织进行固定和透化处理。进行免疫染色时，荧光团与目标抗原的抗体结合，然后使用成像显微镜观察荧光信号。根据使用的抗体和所需的信号扩增，免疫荧光可分为直接和间接两种类型。免疫荧光技术可以通过荧光信号显示和检查细胞或组织内的抗原或半抗原物质。

注意:从加荧光二抗起,后面所有操作步骤都尽量在较暗处进行.DAPI复染核:爬片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育10min。封片：爬片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。玻片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。镜检拍照：切片于荧光显微镜下观察并采集图像。（DAPI紫外激发波长330-380nm，发射波长420nm，发蓝光；FITC激发波长465-495nm，发射波长515-555nm，发绿光；CY3激发波长510-560，发射波长590nm，发红光）。两种抗体同时孵育：由于FIT容易萃灭，因此在孵育抗体时后孵育FITC二抗(孵育二抗一定要避光。免疫荧光技术可以用于研究细胞信号传导和信号通路。CD68免疫荧光试验

荧光抗原法是利用已知的荧光标记物来追踪或检查相应抗体的方法。CD68免疫荧光试验

细胞免疫荧光实验常见问题:1、信号弱或者无信号：细胞或组织样本保存时间过长；2）抗体浓度不合适，参照抗体说明书的稀释浓度，再根据样本表达量进行摸索；3）一抗孵育时间不合适，建议 4 ℃ 过夜孵育。2、高背景：封闭不充分；抗体浓度过高；抗体孵育时间过长或温度过高；清洗不充分；样本变干，染色过程确保样品始终浸没于液体环境中.3、非特异性染色较多：固定液残留，这里需要缩短固定时间并且在封闭液中加甘氨酸，并且抗原修复也可以帮助解决非特异性染色；二抗残留，二抗需要用带有吐温 20 的 PBS 溶解，只要荧光显微镜的强度还可以增大，那么就可以增加吐温洗脱掉非特异性染色。CD68免疫荧光试验