细胞免疫荧光:细胞种板与细胞爬片制备:1) 细胞密度在90%-95%左右,用预热胰酶消化细胞后重悬细胞于完全培养基中,充分吹打,使之成单细胞悬液,计数。2)取细胞培养12孔板,在每个孔放爬片的位置根据爬片的大小,先在每个孔里准备放爬片的位置滴几滴培养基,然后将爬片置于液滴上,压紧,使爬片与培养皿靠培养基的张力粘合到一起,防止加细胞悬液时爬片漂起,造成双层细胞贴片。根据自己的需要选择合适的细胞密度种入12孔板培养板内。3)24h或者48h后,根据细胞生长速度快慢,观察判断细胞密度,约90%时进行细胞免疫荧光。免疫荧光技术可以用于研究遗传疾病和基因表达调控。VEGFA免疫组化
其他荧光物质:酶作用后产生荧光的物质某些化合物本身无荧光效应,一旦经酶作用便形成具有强荧光的物质。例如4-甲基伞酮-β-D半乳糖苷受β-半乳糖苷酶的作用分解成4-甲基伞酮,后者可发出荧光,激发光波长为360nm,发射光波长为450nm。其他如碱性酸酶的底物4-甲基伞酮磷酸盐和辣根过氧化物酶的底物对羟基乙酸等。镧系螯合物某些3价稀土镧系元素如铕(Eu3)、铽(Tb3)、铈(Ce3)等的螯合物经激发后也可发射特征性的荧光,其中以Eu3应用较广。Eu3螯合物的激发光波长范围宽,发射光波长范围窄,荧光衰变时间长,较适合用于分辨荧光免疫测定。VEGFA免疫组化荧光抗体标记使得抗原定位变得可视化,有助于观察细胞结构和功能。
免疫荧光技术又称荧光抗体技术,是标记免疫技术中发展较早的一种。它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。很早以来就有一些学者试图将抗体分子与一些示踪物质结合,利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位。免疫荧光技术是标记免疫技术中发展较早的一种.它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。Coons等于1941年初次采用荧光素进行标记抗体获得成功。经过几十年的发展,该技术已相当成熟。用荧光抗体示踪或检查相应抗原的方法称荧光抗体法;用已知的荧光抗原标记物示踪或检查相应抗体的方法称荧光抗原法。这两种方法总称免疫荧光技术。在实际工作中荧光抗原技术很少应用,所以人们习惯将荧光抗体技术称为免疫荧光技术
免疫荧光的制作:样品准备(贴壁细胞、悬浮细胞以及组织等):对于贴壁细胞:先将洁净的盖玻片在70%乙醇中进行浸泡处理,然后用干净无菌的镊子放置到培养皿中,用无菌PBS洗去残留的乙醇。待细胞接近长成单层后取出盖玻片,操作小心,防止细胞脱片。对于悬浮细胞:有2种方法,①先在悬浮液中进行固定步骤,然后把细胞滴加在载玻片上,干燥后细胞会紧贴在载玻片上。②先在悬浮液中进行固定和染色步骤,离心洗脱,然后用移液管移至盒式玻片进行后续染色步骤。对于冷冻切片:切片放置在载玻片上后,可以直接进行固定等后续操作。对于石蜡切片:免疫荧光中石蜡切片较少,要先进行脱蜡和抗原修复处理。免疫荧光技术可以用于研究疾病的发生机制和医治效果评估。
荧光标记二抗的选择普遍;与使用荧光素结合一抗的检测相比,成本较低。间接免疫荧光的缺点:由于需要具有两种不同物种反应性的两种抗体,因此物种交叉反应性问题增加;与直接免疫荧光相比,时间更长(操作步骤更多)。间接免疫荧光的优点:通过增加能够与一抗结合的二抗数量进行信号放大;与直接免疫荧光相比,通过信号放大提高检测灵敏度;荧光标记二抗的选择普遍;与使用荧光素结合一抗的检测相比,成本较低。间接免疫荧光的缺点:由于需要具有两种不同物种反应性的两种抗体,因此物种交叉反应性问题增加;与直接免疫荧光相比,时间更长(操作步骤更多)。免疫荧光技术可以用于研究植物病理学和农业生产。Glut2免疫组化
免疫荧光技术可以通过荧光显微镜观察样品中的荧光信号,从而确定目标分子的存在和位置。VEGFA免疫组化
免疫荧光间接法:如检查未知抗原,先用已知未标记的特异抗体(一抗体)与抗原标本进行反应,用水洗去未反应的抗体,再用标记的抗抗体(第二抗体)与抗原标本反应,使之形成抗体—抗原—抗体复合物,再用水洗去未反应的标记抗体,干燥、封片后镜检。如果检查未知抗体,则表明抗原标本是已知的,待检血清为一抗体,其它步骤的抗原检查相同。标记的抗抗体是抗球蛋白抗体,同于血清球蛋白有种的特异性,如免疫抗鸡血清球蛋白只对鸡的球蛋白发生反应,因此,制备标记抗体适用于任何抗原的诊断。VEGFA免疫组化
在神经系统疾病的研究和诊断中,免疫组化发挥着独特的作用。神经系统结构复杂,细胞种类繁多,许多神经系统疾病的发病机制尚不明确。免疫组化技术为我们提供了一个探索神经系统微观世界的有力工具。以阿尔茨海默病为例,其主要病理特征是大脑中β-淀粉样蛋白(Aβ)的沉积和神经纤维缠结(NFTs)。免疫组化可以特异性地标记Aβ和NFTs中的tau蛋白,让病理学家清晰地观察到这些病理改变在大脑中的分布情况。这有助于我们深入理解阿尔茨海默病的发病过程,从细胞和分子水平探索疾病的起源。在神经系统**的诊断方面,免疫组化也有着重要意义。例如,通过检测胶质纤维酸性蛋白(GFAP)可以确定**是否来源于神经胶质细胞,这对于...