细胞爬片的免疫荧光步骤基本一致:1. 取出细胞爬片放到35mm或60mm用过的细胞培养皿里,PBS洗三遍。注意:有的时候作的细胞爬片可能比较小,因此夹取的时候要小心,注意 反正面,放在皿里洗比较方便,避免了来回夹取,另外洗的时候加PBS不要太冲,不要细胞冲下来。洗的时候我都是多加PBS,稍晃一下就倒掉,没有等5分钟或10分钟。2. 4%冷的多聚甲醛固定20分钟,PBS洗三遍。3. 0.2%Triton X-100通透10分钟,PBS洗三遍。4. 与二抗相同宿主的血清封闭30分钟,PBS洗三遍。5. 一抗4度湿盒内过夜,也可37度2小时,感觉前者效果好,PBS洗三遍。6. 二抗室温2小时(避光),或者37度1半小时,PBS洗三遍。7. 较好用DAPI染核,然后直接照荧光片。8. 蒸馏水洗掉PBS,甘油封片,指甲油封片子的四周,因为甘油不象树脂那样会干,所以不用指甲油封的话会弄的一塌糊涂。免疫荧光技术是将抗体与荧光素等示踪物质结合,通过抗原抗体反应进行定位。BGLAP/OCN免疫组化
免疫荧光通透(目的是使抗体进入胞内),0.5%TritonX-100(一种去垢剂,用PBS配制)室温通透20min(针对胞内抗原,若是细胞膜上表达的抗原则省略该步骤);除了TritonX-100,也可作为通透剂,并且固定后的样品不需要通透。封闭(减少一抗和二抗与非特异位点进行结合),通透后用PBS浸洗玻片3次,每次3min,吸水纸吸干PBS,在玻片上滴加山羊血清,室温封闭30min。常用的封闭液包括:与二抗同一来源的血清、BSA或者是羊血清。从封闭开始所有的步骤,一定要注意样品的保湿,避免样品的干燥,否则极易产生较高的背景。醛类固定的样品,在用一抗孵育前用含0.3M甘氨酸的封闭液进行封闭。collagenX(COL-10)免疫检测荧光抗体标记使得抗原定位变得可视化,有助于观察细胞结构和功能。
其他荧光物质:酶作用后产生荧光的物质某些化合物本身无荧光效应,一旦经酶作用便形成具有强荧光的物质。例如4-甲基伞酮-β-D半乳糖苷受β-半乳糖苷酶的作用分解成4-甲基伞酮,后者可发出荧光,激发光波长为360nm,发射光波长为450nm。其他如碱性酸酶的底物4-甲基伞酮磷酸盐和辣根过氧化物酶的底物对羟基乙酸等。镧系螯合物某些3价稀土镧系元素如铕(Eu3)、铽(Tb3)、铈(Ce3)等的螯合物经激发后也可发射特征性的荧光,其中以Eu3应用较广。Eu3螯合物的激发光波长范围宽,发射光波长范围窄,荧光衰变时间长,较适合用于分辨荧光免疫测定。
免疫荧光检测相对于酶检测的优势:定量荧光信号的能力(与使用基于酶的方法进行的定性测定相反);复用能力(可以结合不同发射光谱的荧光染料来检测多种蛋白质);荧光染料的光稳定性。免疫荧光技术是根据抗原抗体反应的原理,先将已知的抗原或抗体标记上荧光素,制成荧光抗体,再用这种荧光抗体(或抗原)作为探针检测组织或细胞内的相应抗原(或抗体)。在组织或细胞内形成的抗原抗体复合物上含有标记的荧光素,利用荧光显微镜观察标本,荧光素受外来激发光的照射而发生明亮的荧光(黄绿色或橘红色),可以看见荧光所在的组织细胞,从而确定抗原或抗体的性质、定位,以及利用定量技术测定含量。免疫荧光技术可以用于研究细胞迁移和细胞黏附。
免疫荧光应用范围:其应用范围极其普遍,可以测定内分泌、蛋白质、细胞因子、细胞表面抗原、多肽、核酸、受体、神经递质、肉瘤标志物、血药浓度等各种生物活性物质。根据诊断类别,又可分为传染性疾病、内分泌、药物检测、免疫学、血型鉴定等。免疫荧光实验步骤:洗涤:PBS洗涤5min*3次。封闭:使用封闭液对样本进行封闭,一般1h。加一抗:使用合适浓度的一抗与样本4℃过夜。洗涤:PBS或PBST洗涤5min*3次。加二抗:使用间接法时需要加二抗处理,根据说明书使用合适的浓度,避光处理1h(后面步骤均需避光)。洗涤:PBS或PBST洗涤5min*3次。封片:滴一滴防淬灭剂,封片。可立即观察后暂存4℃尽快观察。免疫荧光技术可以用于研究遗传疾病和基因表达调控。collagenX(COL-10)免疫检测
免疫荧光细胞化学技术用于显示和检查细胞或组织内的抗原或半抗原物质。BGLAP/OCN免疫组化
免疫荧光固定(防止离体组织自溶抗原扩散),固定液包括:有机溶剂(甲醇、乙醇等);交联剂(4%PFA、10%中性福尔马林),固定液的选择取决于被研究抗原的性质及所用抗体的特性,不过,目前甲醛用的还是较多的,但针对磷酸化的抗体,不适合用甲醛,会导致磷酸蛋白从膜表面转移到胞浆中,故应选择冰冷的无水甲醇或无水乙醇,同时应注意甲醛会挥发,在4-8°C不宜储存太久。固定时间:取决于组合块的大小和类型,对于大多数组织,18-24h较为理想,细胞固定时间较短,一般2%的甲醛室温固定20min即可。以细胞样品为例:用4%的多聚甲醛固定爬片15min,PBS浸洗玻片3次,每次3min。BGLAP/OCN免疫组化
在神经系统疾病的研究和诊断中,免疫组化发挥着独特的作用。神经系统结构复杂,细胞种类繁多,许多神经系统疾病的发病机制尚不明确。免疫组化技术为我们提供了一个探索神经系统微观世界的有力工具。以阿尔茨海默病为例,其主要病理特征是大脑中β-淀粉样蛋白(Aβ)的沉积和神经纤维缠结(NFTs)。免疫组化可以特异性地标记Aβ和NFTs中的tau蛋白,让病理学家清晰地观察到这些病理改变在大脑中的分布情况。这有助于我们深入理解阿尔茨海默病的发病过程,从细胞和分子水平探索疾病的起源。在神经系统**的诊断方面,免疫组化也有着重要意义。例如,通过检测胶质纤维酸性蛋白(GFAP)可以确定**是否来源于神经胶质细胞,这对于...