问：能否用FPKM进行差异分析？
答：在做差异分析时，我们是采用readcount数据，通过DESeq或者TMM标准化后，进行差异分析。FPKM实际上也是对readcount进行标准化处理的一种方法，各种标准化方法优劣势比较见下图(Dillies, M. A. et al, 2013)，可以看出，在进行差异分析时，DESeq和TMM的标准化效果比较好，FPKM的标准化效果较差，所以，不推荐使用FPKM进行差异分析。
问：为什么要用校正后的p值，能直接用p_value吗？
答：校正后的p值（padj/qvalue），是对p值进行了多重假设检验，能更好地控制假阳性率 转录组找上海融享生物科技有限公司。云南cirRNA转录组测序公司
生物学重复是任何生物学实验所必须的，高通量测序技术也不例外。生物学重复主要有两个用途：一个是证明所涉及的生物学实验操作是可以重复的且变异不大，另一个是为了确保后续的差异基因分析得到更可靠的结果。样品间基因表达水平相关性是检验实验可靠性和样本选择是否合理的重要指标。相关系数越接近1，表明样品之间表达模式的相似度越高。Encode计划建议皮尔逊相关系数的平方(R2)大于0.92(理想的取样和实验条件下)。具体的项目操作中，我们要求生物学重复样品间R2至少要大于0.8，否则需要对样品做出合适的解释，或者重新进行实验。根据各样本所有基因的表达值：RPKM，计算组内及组间样本的相关性系数，绘制成热图，可直观显示组间样本差异及组内样本重复情况。样本间相关性系数越高，其表达模式越为接近陕西真核有参转录组测序公司哪家好高通量测序平台包括Illumina HiSeq X Ten，HiSeq，MiSeq，PacBio Seque等。
将各样品过滤后的测序序列与参考基因组进行比对(mapping)，使其定位到基因组。 本项目分析中，我们使用HISAT2软件进行mapping。参考基因组为Rattus_norvegicus。所用的软件为HISAT2。HISAT采用全局和局部搜索的方法能够有效的比对到RNA Seq测序数据中的spliced reads，是目前比对率比较高 且比较准确的比对软件。在分析过程中，采用软件默认参数
HISAT2的算法主要分为三个部分：
将测序序列整段比对到基因组单外显子
将测序序列分段比对到基因组的两个外显子上
将测序序列分段比对到基因组三个以上（含三个）外显子
高通量表达谱芯片的探针数量可以从几千到数百万，可以在全基因组水平检测基因表达谱的改变，但具有检测成本相对昂贵,需要的起始模板量大，假阳性率高等缺点。功能分类基因表达谱芯片研制和应用的前提是当我们对某一生物学通路或病理过程及参与的基因已经有相当明确的研究时，在此基础上,对相关的基因进行了有目的的筛选与分类组合，从而设计出*针对某一生物学通路或病理过程研究的表达谱芯片，探针数目*有几十到数百，因而杂交条件易于优化，具有灵敏度高、准确可靠和重复性好的优点。例如，**的发生与血管的发生密切相关，而与血管发生相关的基因已有比较清楚的研究,研究者就可以将已知的与血管发生相关的基因**起来，设计出检测血管发生的功能表达谱芯片，可用于监测**的发生与发展。高通量转录组测序找融享生物。
转录组测序技术（RNA-seq）经历测序技术的发展，目前几乎已经成为了各种生物学研究的基础，无论是疾病机制研究、生理调控等均有广泛应用。
环状RNA测序（circRNA）：由于环状RNA的闭合环状特性，通过去除totalRNA中的rRNA和线性RNA分子，可以特异地富集环状RNA分子后测序，更有针对性地分析受检样本中特定的环状RNA谱、环状RNA剪接模式、组间差异和分子功能等。CircRNA功能众多，可作为miRNA的海绵，竞争性结合miRNA，发挥ceRNA的调控功能，调控基因表达。近年来还发现与疾病的发生和发展密切相关，在疾病诊断标记物等方向具有很大的应用前景。 转录组测序，提供更精确的数字化信号，更高的检测通量以及更多的检测范围。陕西全长转录组测序公司
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问：Read-1,Read-2的具体含义是什么？答：双端测序会在cDNA片段的两端先后读取一定长度的碱基（如pe150，就是分别测150bp）得到一对reads，其中一条称为Read-1，另一条称为Read-2。大量文献和实际项目都表明，转录组分析中使用双端reads对于序列拼接和定量都大有裨益。
基因表达水平一般是通过该基因转录的mRNA的多少来衡量的。每个基因转录产生的mRNA的量，是受到时空等多种因素调控的，个体在不同的生长发育阶段，或者不同的组织水平,或者响应不同的实验处理，基因转录出mRNA的量都是不一样的。我们通过featurecounts(Liao Y, Smyth GK and Shi W., 2014)软件统计基因的表达量。 云南cirRNA转录组测序公司
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