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虽然在荧光定量 PCR 检测时的过程比较 简单，但是在前期样本制备阶段却存在着很多影响因素，因此从 siRNA 序列的设计、质粒的共转染、细胞总 RNA 的提取、质粒 DNA 的去除、cDNA 的获得、试剂的 选择及后续的操作步骤都应优化稳定到比较好方案，方 能保证其结果的准确性。实时荧光定量 PCR 技术在 mRNA 表达研究、基因组和病毒核酸的定量测定和等位基因的差异分析等领域的应用越来越***。通过本设计性实验可以加深学 生对实时荧光定量 PCR 技术及其应用的理解，为今后 的科研工作打下基础。的不同qPCR会有不同的优势。江西SYBRGreen法qPCR机构

SYBR GreenI 的优点在于:①成本较 低, 不需合成和标记探针 ;②适合初步筛查:选用 SYBR 筛查 , 再用探针法精确定量少数关键样品 。 但SYBR GreenI 缺点有:①特异性差 , 不能分辨主带与杂带 , 给 出的是总信号, 所以在低样本浓度时,不能进行基因 突变分析 。但该方法可利用熔点曲线分析将特异产 物、引物二聚体和非特异性产物区别开来,不需要通 过电泳鉴定(Qzaki 等 , 1992);②不能做多重检测 , 每孔只能检测 1 个目标基因;③灵敏度低, 适合于 5000 拷贝以上的基因定量。黑龙江相对定量qPCR电话上海融享生物科技有限专业qPCR公司。

在 PCR 反应体系中，加入过量的 SYBR Green Ⅰ荧光 染料，使其特异地与 dsDNA 分子结合后，发射荧光信 号，荧光强度随着聚合反应的进行逐渐增加; 因此，可 被荧光探测系统检测到，荧光强度的增加与初始模板 量相关，可以进行定量 DNA 分析。荧光染料的优势 在于它能监测任何 dsDNA 序列的扩增，不需要探针 的设计，检测方法简便，降低了检测成本。然而，由于 荧光染料能与任何 dsDNA 分子结合，也能与非特异

性的 dsDNA 分子( 如引物二聚体) 结合，产生荧光干 扰，使试验产生假阳性结果。目前，可以用带有熔解 曲线分析的软件解决这个问题。

实时荧光定量 PCR 能对

低丰度 mRNA 进行定量，并且可在体外对细胞活性

进行评估。细胞因子是一种调节蛋白，对免疫反应和 炎症反应都具有重要的调节作用，其量的改变常与某 些疾病，如炎症反应、自身免疫性疾病、移植排斥等有 密切关系。由于得到的组织样本常常因为太小而不 能满足在蛋白质水平上的检测，所以应用实时定量 PCR 技术检测细胞因子 mRNA 表达水平显得更有 意义。

实时荧光定量 PCR 技术的出现不仅加强了对基

因量的研究方法，也加强了对基因质的变化研究。它 可以检测基因突变和基因组的不稳定性，并已经被广

泛应用于遗传分析。 qPCR多种项目供您选择。

在荧光定量 PCR 中，对整个 PCR 反 应扩增过程进行实时监测和连续分析荧光信号，随着

反应时间的延续，监测到的荧光信号可以绘制成一条 曲线。在 PCR 反应早期，产生荧光的水平不能与背 景明显区别，而后荧光的产生进入指数期、线性期和 平台期，在 PCR 反应处于指数期的某一点检 测 PCR 产物的量，并由此可以推断模板初始的含

量。为了准确判断样品中某基因产物的起始拷贝 数，荧光定量 PCR 采用参数“Ct”值，Ct 值 ( cycle threshold) 是指每个反应管内的荧光信号到达设定的

阈值时所经历的循环数 上海融享生物科技有限公司主营qPCR很多，其中销很好。天津相对定量qPCR公司电话

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实时荧光定量 PCR 中的 3 个概念，即基线、阈值与 CT

值是理解其原理的关键。在线性图谱中，基线体现在与 X 轴

平行的部分，对数图谱中，它体现在背景信号杂乱的部分，系

统会自动形成基线的起始循环数与终止循环数，也可手动

调节。荧光阈值指的是荧光强度值，将它界定为 3~15 个循

环的荧光信号标准差的 10 倍[2]，在扩增曲线里，穿过阈值与

X 轴形成的平行线即为阈值线，系统可自动形成也可手动

设置，手动设定阈值时，在指数增长期内重复性好的范围内 江西SYBRGreen法qPCR机构

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