Bio-Rad 的 qPCR 设备全系标配 8 个温度梯度功能，只要运行一次实验，就能找到较合适的退火温度条件。专门的蜂巢式反应模块，保证了很好的温度均一性，即使在较快的升降温过程中同样如此。优化温度梯度实验中，你只需要配好 8 个组分完全相同的反应体系（模板量适中即可）。在然后的结果中，能到得到较小 Cq 值的温度点即为比较好退火温度。通常，比较好的退火温度是狭窄的一个范围，而不是单一的温度点，比如 57℃～58℃ 即为比较好的退火温度。对于染料法的 qPCR 体系，还要通过熔解曲线分析检查各退火温度下产物的特异性情况，优先没有非特异性扩增，且 Cq 值较小的退火温度为较适退火温度。上海融享生物科技有限公司相对定量qPCR服务。宁夏TaqMan探针法qPCR实验
扩增曲线异常，比如S型曲线参比染料设定不正确：MasterMix不加参比染料时，选NONE。模板的浓度太高或者降解。荧光染料的降解。定量PCR仪的开关机顺序是怎样的？按照正确的开关机顺序操作，有助于延长仪器的使用寿命，减少仪器出故障的频率。开机顺序：先开电脑，待电脑完全启动后再开启定量PCR仪主机，等主机面板上的绿灯亮后即可打开定量PCR的收集软件，进行实验。关机顺序：确认实验已经结束后，首先关闭信号收集软件，然后关掉定量PCR仪主机的电源，然后关闭电脑。陕西SYBRGreen法qPCR电话为什么我的qPCR每次结果都不太一样？
稳定和精确的qPCR实验常和PCR效率有关。当靶基因相对于参考基因的mRNA浓度时PCR的效率特别重要。△△Cq法是基于单一参考基因的标准化当下流行确定不同浓度样本的差异性的方法。计算靶基因和参考基因Cq值(△Cq)的差异，直接比较不同样本△Cqs。扩增两个基因以比较这两个基因的效率。但是当下流行的方法不一定是较合适的，不过现在已开发替代的定量模型用于纠正扩增效率，还可以使用多个参考基因。PCR扩增效率必须建立校准曲线，因为这种校准提供了一个简单、快速以及可重复PCR效率、分析敏感性和实验的稳定性的平均指标。效率放大应当从l校准曲线的og线性部分的斜坡部分决定。具体而言PCR效率＝10-1/slop-1，初始模板浓度的对数(单独变量)是X轴，Cq(依赖变量)是Y轴。理论较大值为1.00(或100%)表示每个周期的产物量加倍。理想状态下PCR的估计平均效率的CIs或SEs服从校准曲线。
能否通过增加扩增循环数来增加试剂盒的敏感性？这里指的是大部分的qPCR试剂盒的循环数为40个或45个，我们能否在不改变试剂盒的设计的前提下，只通过将40个循环增加到45个循环，或是将临界值由38提高到40，或者由40提高到45的方式来提高试剂盒的敏感性呢？从原理上解释：理论上，假设初始模板量为1个拷贝，酶的扩增效率100%，到达比较大阈值约需要35个循环，因此业内通常认为qPCR的有效线性范围为Ct:15-35。通常酶的扩增效率无法达到100%，达到1个拷贝模板的循环数可能会达到38或更高，如下图我用qPCR和数字PCR测到了1拷贝模板对应的Ct值为37.91。当酶的效率更低或者存在抑制剂时，检测到1拷贝模板的循环数的Ct值可能会更高。qPCR的好处有些什么？
提取样本中的RNA定量分析很重要，因为比较不样本时，使用大致相似相同数量的RNA是明智的。平常使用的有几种量化方法，如分光光度法(NanoDrop;ThermoScientific)，微流控分析法(AgilentTechnologies’Bioanalyzer,Bio-RadLaboratories’Experion)，毛细管凝胶电泳法(Qiagen’sQIAxcel)，或者荧光染料检测法(Am-bion/AppliedBiosystems’RiboGreen)。这些方法可以有不同的结果，因此用不同方法比较结果是不明智的。定量RNA推荐使用荧光RNA结合染料(如RiboGreen)，该方法是检测低浓度样本比较好的方法。建议任何情况下检测所有样本使用同一种方法，并且报道这些信息。外源性基因组DNA污染程度和这种污染容忍的阈值也是很重要的。必须报道RNA样本是否经过DNase处理(包括DNase类型和反应条件)，每个核酸样本的获得的Cqs研究组和非反转录的控制组的阳性果之间比较结果。您知道qPCR的优势吗？陕西SYBRGreen法qPCR电话
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qPCR是不是会做不好呢？即使是看了人家文献里的PCR方法，照搬了人家的引物，还是做得每次结果都不一样？其实具体原因有这么几个。首先，你基本上不太会用移液头。移液头特别是微量移液头，特别长期快速操作，也就是说弹簧没来得及恢复又进行下一步按压。极其容易导致……你的大拇指关节受损。好吧，这都是其次，关键是你的移液量可能都会有变化。所以，关爱拇指，吸取液体时，保持1-2秒，给弹簧一个缓冲。当然，在加模板的时候，提高模板加样量，也可以尽可能减少每次加样的误差。吸取液体的时候，需要把头插入凹液面底部，而不是插到凹液面的侧面。侧面比较容易产生气泡：当然，你会说，每次头都插很深，但是这样的话，就很容易在头上沾上液滴，在微量的模板加样时，很容易导致加样量的误差。宁夏TaqMan探针法qPCR实验
