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x - 轴表示 PCR 循环数, y - 轴表示扩增 反应的荧光值 ,与反应管中扩增产物的量有比例关 系。扩增曲线有指数增长期和非指数平台期 2 个阶 段。在指数增长阶段,每个循环 PCR 产物量大约增 加一倍。然而随着反应的进行, 反应体系组成成分 的消耗,反应进入平台期。只有在荧光信号扩增期 PCR 产物量的对数值 与起始模板量之间存在线性关系 , 可以在指数期的 某一点上来检测 PCR 产物的量,并由此推断模板初始的含量。设定一定的荧光信号的域值 (thresh - old)。如果检测到荧光信号超过域值, 就被认为是 真正的信号 ,它可用于定义样本的域值循环数 Ct (C 表示循环 cycle , t 表示域值 threshold )对于不同的需求我们选择不同的qPCR。宁夏TaqMan探针法qPCR公司电话

实时荧光定量 PCR双标准曲线即靶基因以及内参基因

各对应的一套标准曲线。假设靶基因的平均扩增效率为

E3， 在待测样品以及校准样品中的初始拷贝数分别为 N3 与 N4，当达到某一阈值时，该靶基因在待测样品以及校准样品

中检测到的 CT 值分别为 CT3 与 CT4，则有 C3·N3

·（1+E3）

CT3=C4· N4

·（1+E3）

CT4 （其中，C3 与 C4 分别为待测样品以及校准样品

的浓度），假设内参基因的平均扩增效率为 E4，内参基因在

待测样品以及校准样品中的初始拷贝数分别为 N3′与 N4′，

当达到某一阈值时，内参基因在待测样品以及校准样品中

检测到的 CT 值分别为 CT3′与 CT4′，则有 C3·N3′·（1+E4）

CT3′= C4·N4′·（1+E4）

CT4 ′，则靶基因与内参基因在待测样品中的拷贝

数比值 N3/N3′=N4/N4′·（（1+E3）

CT4-CT3 /（1+E4）

CT4 ′-CT3 ′

），其中，N4 为

靶基因在校准样品中的初始拷贝数，校准样品中靶基因的

拷贝数是已知的，并 且 是 经 过 Southern 杂 交 验 证的；N3′与 N4′是指内参基因在待测样品以及校准样品中的初始拷贝

数，在拷贝数变异检测中，内参基因需具有“同一物种内具

有恒定低拷贝”这一特点，也就是 N3′=N4′，故靶基因在待测

样品中的初始拷贝数 N3=N4

·（1+E3）

CT4-CT3 /（1+E4）

CT4 ′-CT3 ′。

该探针是长度为 20 ～ 24 bp 的寡核苷酸，在其 5' 末端标记 1 个荧光报告基团，3'末端标记 1 个荧光淬 灭基团，其序列与 2 个引物包含序列内的 1 段 DNA 模板完全互补。该方法是当探针保持完整时利用 Taq 酶( 5'→3'外切酶) 的活性淬灭基团吸收发射的 荧光。当有特异的而不是非特异的 PCR 发生时，Taq 酶同时发挥其 5'→3'外切酶活性，将与模板杂交的探 针切碎，报告基团与淬灭基团分离，淬灭作用被解除， 荧光信号释放，通过检测系统就可以观察到信号的变 化，荧光信号的累积与 PCR 产物形成呈正相关。

在 PCR 反应体系中，加入过量的 SYBR Green Ⅰ荧光 染料，使其特异地与 dsDNA 分子结合后，发射荧光信 号，荧光强度随着聚合反应的进行逐渐增加; 因此，可 被荧光探测系统检测到，荧光强度的增加与初始模板 量相关，可以进行定量 DNA 分析。荧光染料的优势 在于它能监测任何 dsDNA 序列的扩增，不需要探针 的设计，检测方法简便，降低了检测成本。然而，由于 荧光染料能与任何 dsDNA 分子结合，也能与非特异

性的 dsDNA 分子( 如引物二聚体) 结合，产生荧光干 扰，使试验产生假阳性结果。目前，可以用带有熔解 曲线分析的软件解决这个问题。 上海融享生物科技有限公司主营qPCR包括。

分子信标(molecular beacons)是 TaqMan 探针的衍生形式。它是由一种单链 DNA 形成的发夹结构 ,一端标记报告基团, 另一端标记 淬灭基团 , 当形成发夹结构时 , 荧光报告基团与淬 灭基团相互靠近 , 发生 FRET , 当热循环温度达到 分子信标的解链温度时 ,其构象发生改变 , 能与模 板结合而完全伸展成线性分子 , 使 FRET 消失 , 报 告基团发出荧光信号 。与探针互补的模板数量越 多荧光信号越强 , 以此达到定量的目的 。分子信 标特别适用于检测点突变 , 能区分只有一个核苷 酸差异的不同 DNA 序列 ,而且其敏感性远比同等 长度的寡核苷酸探针要高 。qPCR项目找上海融享生物科技有限公司。内蒙古实时荧光定量qPCR机构哪里有

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环次数，与靶点的初始量成反比。整个扩增过程，基线决定

阈值，阈值决定 CT 值，为了保证试验结果的准确性，需保证

扩增曲线的基线以及阈值设置的合理性。系统一般将基线

起始循环数设为 3，正确的基线终止循环数很重要，若背景

信号过强，系统会将背景信号误判为扩增信号，自动生成的

基线范围比实际范围小，影响扩增曲线的带型以及检

测到的 CT 值，这种情况可手动设置基线终止循环数，一般

将其设为该样品开始扩增的前一个循环。 宁夏TaqMan探针法qPCR公司电话

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