细胞经诱导或阻止后,需对自噬过程进行观察和检测,常用的策略和技术有:1、观察自噬体的形成:由于自噬体属于亚细胞结构,普通光镜下看不到,因此,直接观察自噬体需在透射电镜下。Phagophore的特征为:新月状或杯状,双层或多层膜,有包绕胞浆成分的趋势。自噬体(AV1)的特征为:双层或多层膜的液泡状结构,内含胞浆成分,如线粒体、内质网、核糖体等。自噬溶酶体(AV2)的特征为:单层膜,胞浆成分已降解。2、在荧光显微镜下采用GFP-LC3融合蛋白来示踪自噬形成:由于电镜耗时长,不利于监测自噬形成,人们利用LC3在自噬形成过程中发生聚集的现象开发出了此技术。无自噬时,GFP-LC3融合蛋白弥散在胞浆中;自噬形成时,GFP-LC3融合蛋白转位至自噬体膜,在荧光显微镜下形成多个明亮的绿色荧光斑点,一个斑点相当于一个自噬体,可以通过计数来评价自噬活性的高低。自噬过程与内涵体途径密不可分。黑龙江细胞自噬整体实验
自噬的功能:(1)饥饿应答时的作用,在不同的部位如肝脏或在培养细胞中,氨基酸的匮乏会诱导细胞产生自体吞噬,由自体吞噬分解大分子,产生在分解代谢和合成代谢过程中所必须的中间代谢物。(2)在细胞正常活动中的作用,如在动物的异常发育、老化和分化过程中,自体吞噬负责降解正常的蛋白以重新组建细胞。尽管通常人们认为自体吞噬不具有选择性,但是在某些病理和压力条件下,通过自体吞噬能选择性地隔离某些细胞器,如线粒体、过氧化物酶体等。(3)在某些组织中的特定功能,如黑质的塞梅林神经节中,多巴胺能神经元中的神经黑色素的合成就需要把细胞质中的多巴胺醌用AV包被隔离起来。自噬是一种通过溶酶体在细胞内部降解功能失调的细胞组分的过程。安徽mRFP-GFP-LC3双荧光自噬自噬体延伸与形成:吞噬泡的延伸会导致形成自噬体,一般为双层膜细胞器。
目前越来越多的研究结果揭示了细胞自噬在天然免疫反应中的重要调控作用,崔隽教授课题组先后发现选择性自噬能够通过调控天然免疫受体和适配体分子AIM21、cGAS2、RIG-I3、MAVS4以及经典NF-kB信号通路中IKKb激酶5的蛋白稳定性,负向调控炎症反应和I型干扰素反应的新通路。本项工作进一步揭示了选择性自噬对非经典NF-kB通路中转录因子的动态调控,加深了我们对于选择性自噬和天然免疫信号通路之间密切联系的认识。许多研究已将自噬缺陷作为神经退行性疾病的病理原因之一,包括阿尔茨海默病,帕金森氏病和亨廷顿氏病等等。
目前认为,自噬体的膜不是直接来源于高尔基体或内质网,而是在胞浆中重新生成的,但具体的机制尚不清楚。当beclin-1被活化后,胞浆中先形成比较多个membranesource(自噬体膜发生中心),在它们不断扩展的过程中,VMP1蛋白由内质网和高尔基体转位到自噬体膜上(VMP1又叫TMEM49,已知唯独与自噬有关的跨膜蛋白),同时,MAP1-LC3由胞浆型(即LC3-I)转位到自噬体膜(即LC3-II),LC3这一转变过程可被WesternBlot和荧光显微镜检测到,现已成为监测自噬体形成的推荐方法。UA可引导粒线体的自噬作用,并防止有功能障碍粒线体的累积。在囓齿动物理,UA可经由粒线体引发增进运动能力,这些新的发现建议UA在增进粒线体和肌肉功能方面有医药潜力。发生传染时,可通过自噬调控炎症、抗原及微生物捕捉与降解。
选择性自噬是真核生物体内清理蛋白、受损细胞器和外源微生物的基础生理过程。而蛋白的翻译后修饰,特别是泛素化修饰能够作为选择性自噬中的底物识别的重要信号。崔隽教授课题组发现选择性自噬参与调控非经典NF-kB信号通路的重要过程。选择性自噬中的货物受体p62通过识别p52/p100的N端上的K63泛素化链进而促使p52/p100发生自噬降解,阻止非经典NF-kB信号通路。有趣的是,已有报道认为p100C端的K48泛素化链是蛋白酶体降解信号。而崔隽教授课题组发现的K63泛素化链修饰并非大家所熟知的蛋白降解信号,但却能被自噬货物受体p62识别并介导蛋白降解,进而调控底物功能,影响生理与疾病进程。相同的细胞在不同的外部因素作用时,自噬的作用可能不同。细胞自噬是真核细胞内一种高度保守的溶酶体依赖的分解代谢过程。河南western blot检测自噬
自噬性溶酶体是一种自体吞噬泡,作用底物是内源性的,即细胞内的蜕变、破损的某些细胞器或局部细胞质。黑龙江细胞自噬整体实验
自噬的步骤可以大概总结为下面四步:步骤1:细胞接受自噬诱导信号后,在胞浆的某处形成一个小的类似「脂质体」样的膜结构,然后不断扩张,但它并不呈球形,而是扁平的,就像一个由2层脂双层组成的碗,可在电镜下观察到,被称为Phagophore,是自噬发生的铁证之一。步骤2:Phagophore不断延伸,将胞浆中的任何成分,包括细胞器,全部揽入「碗」中,然后「收口」,成为密闭的球状的autophagosome,即「自噬体」。电镜下观察到自噬体是自噬发生的铁证之二。有2个特征:一是双层膜,二是内含胞浆成分,如线粒体、内质网碎片等。步骤3:自噬体形成后,可与细胞内吞的吞噬泡、吞饮泡和内体融合(这种情况不是必然要发生的)。步骤4:自噬体与溶酶体融合形成autolysosome,期间自噬体的内膜被溶酶体酶降解,二者的内容物合为一体,自噬体中的「货物」也被降解,产物(氨基酸、脂肪酸等)被输送到胞浆中,供细胞重新利用,而残渣或被排出细胞外或滞留在胞浆中。黑龙江细胞自噬整体实验
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