实时荧光定量 PCR 技术的方法学：所谓 real-time
Q-PCR 技术，是指在 PCR 反应体系中加入荧光基团，
利用荧光信号累积实时监测整个 PCR 进程，后来通过
标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。在
real-time 技术的发展过程中，两个重要的发现起着关
键的作用：①在 20 世纪 90 年代早期，Taq DNA 多聚
酶的 5’核酸外切酶活性的发现，它能降解特异性荧光
标记探针，因此使得间接的检测 PCR 产物成为可能。
②此后荧光双标记探针的运用使在一密闭的反应管中
能实时地监测反应全过程。这两个发现的结合以及相应
的仪器和试剂的商品化发展导致 real-time Q-PCR 方法
在研究工作中的运用。 上海融享生物科技有限公司专业致力于qPCR。北京TaqMan探针法qPCR哪里有
完整的探针包括荧光基团、淬灭基团和寡核苷酸序列三部分，理想的探针应该具有特异性高、荧光本底低等特点。对于寡核苷酸序列的设计一般遵循以下原则：GC含量30%～80%，C碱基要多于G碱基，长度一般15～30bp。过长会影响淬灭效率，导致荧光本底较高；过短则导致特异性下降。Tm值一般比引物的要高5～10℃。5’端不能安置G碱基。G碱基本身具有荧光淬灭的特性，会导致荧光基团被切掉后也无法发出荧光。荧光基团根据检测的多重性灵活选择，一般优先常规的 FAM 和 HEX，同时针对不同的荧光基团选择合适的淬灭基团。安徽实时荧光qPCR公司电话qPCR的优势您了解多少呢？
Ct值能否直接换算成模板拷贝数？通过制作标准曲线（E：90%~110%，R^2≥0.99，斜率-3.58~-3.10）的方法可以获得未知样品的初始模板拷贝数，前提是需要样品与标准品同时扩增，定量标准品需要使用标准物质等定量准确的物质（OD260/280换算的的拷贝数误差很大），即使如此定值结果仍存在一定的误差。荧光定量PCR是否为定量方法？虽然名字里有「定量」，但是qPCR的间接定量方式又复杂，又受很多因素影响，又不准确，在计量领域是不被认可的。目前的核酸检测方法中只有数字PCR是真正的定量检测方法，其余的都是定性检测方法。
耐药基因表达的研究：目前研究中发现主要的
耐药机制有：ATP结合盒基因超家族的膜转运蛋白介导
的耐药，这些蛋白包括：MDR-1基因编码的P-糖蛋白，
多药耐药相关蛋白，肺耐药相关蛋白，乳腺耐药蛋
白等；酶介导的耐药，包括拓扑导构酶，谷胱甘肽及谷
胱甘肽-S-转移酶，蛋白激酶C，脱氧胞嘧啶核苷激酶等，
凋亡基因介导的耐药，如bcl-2家族，p53基因，c-myc
等。多药耐药是多因素，多种机制共同作用的结果。
real-time反转录 PCR是了解耐药指导临床策
略的有用手段，它能观测用药前后及复发时细胞的
耐药基因mRNA表达变化，从而及时调整方案和评
价疾病的预后 您知道qPCR的优势吗？
SYBR GreenI 的优点在于:①成本较 低, 不需合成和标记探针 ;②适合初步筛查:选用 SYBR 筛查 , 再用探针法精确定量少数关键样品 。 但SYBR GreenI 缺点有:①特异性差 , 不能分辨主带与杂带 , 给 出的是总信号, 所以在低样本浓度时,不能进行基因 突变分析 。但该方法可利用熔点曲线分析将特异产 物、引物二聚体和非特异性产物区别开来,不需要通 过电泳鉴定(Qzaki 等 , 1992);②不能做多重检测 , 每孔只能检测 1 个目标基因;③灵敏度低, 适合于 5000 拷贝以上的基因定量。一个好的qPCR项目需要具备哪些特点您了解吗？陕西TaqMan荧光探针qPCR服务
qPCR 常见问题及分析。北京TaqMan探针法qPCR哪里有
做RT-qPCR实验时，大家常常会遇到各种各样的问题，如扩增曲线异常，熔解曲线异常，复孔重复性差，Ct值偏大等，其中Ct值偏大可能是大家较容易遇到的问题。现在就给大家分享下，遇到Ct值偏大问题时该如何解决。RT-qPCR的Ct值偏大主要有两种情况，一种是所有基因Ct都偏大，另外一种是个别基因Ct偏大。所有基因Ct偏大：如果前期所做基因均已做过预实验，Ct值正常，而本次实验，所有基因扩增Ct值都偏大，那很可能是模板质量的原因，如发生了降解，浓度不纯等。可通过Nanodrop和琼脂糖凝胶电泳实验评估RNA的质量，包括浓度、纯度及完整度。北京TaqMan探针法qPCR哪里有
