在采用 SYBR Green I 法进行相对定量时，需要 利用熔解曲线排除非特异产物或引物二聚体对测定结 果的影响。有研究建议在每一个循环中 PCR 延伸后 增加一步，即将温度提高后再检测反应体系中的荧 光［15］。该检测温度大于引物二聚体的退火温度 Tm， 而小于特异性扩增产物的 Tm 值。在此温度下，引物 二聚体都变性成单链，因此只检测到与特异性 PCR 产 物结合的 SYBR Green I 所发出的荧光，消除了引物 二聚体的干扰，降低了非特异性荧光，有助于目标基因 的准确定量。
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因此大量有关qPCR发表的文献中存在结果证据不足甚至是相互矛盾的结果，这对科学研究是一个很大的危险。科学文献的发表和撤回也为人们提出了警示。多数研究报告缺少足够的信息加剧了这个问题，使用qPCR的文献没有提供足够的实验细节，可以让读者评估结果的质量或者重复实验。具体表现为样本的采集和处理信息，RNA质量和完整性，反向转录细节，PCR效率，以及分析参数等等，这些信息常常被忽略，然而样本正规化是反对没有价值的单一参考基因。内蒙古qPCR公司电话TaqMan荧光探针qPCR公司哪家好？
与传统的 PCR 技
术相比，Real-time Q-PCR 的不足之处是：①由于运用
了封闭的检测，减少了扩增后电泳的检测步骤，因此也
就不能监测扩增产物的大小。②因为荧光素种类以及检
测光源的局限性，从而相对地限制了 real-time Q-PCR
的复合式检测的应用能力。③目前 real-time Q-PCR 实
验成本比较高，从而也限制了其的应用
随着技术不断改进和发展，目前 real-time Q-PCR 已
成为科研的主要工具，该技术未来的应用前景是令人鼓舞
的，一方面 real-time Q-PCR 技术与其他分子生物学技术
相结合使定量极微量的基因表达或 DNA 拷贝数成为可
能。另一方面荧光标记核酸化学技术和寡核苷酸探针杂交
术的发展以及 real-time Q- PCR 技术的应用，使定量
PCR 技术有一个足够的基础为广大临床诊断实验室所接
受，将有助于临床医生对疾病的诊断和
数据分析包括原始数据检查，其质量和可靠性评估，以及可值得报告结果的产生。数据采集和提交的变异策略已描述过了，系统性评价显示qPCR的数据分析方法不同于其性能。数据分析方法和可信度估计的详细信息是必须的，同时所使用的软件说明书。确定殿堂值和如何处理这些数据的方法必须指出。记录实验精度需要确认用于评价变异的统计方法(如95%CIs)和相应的浓度或Cq值的出现。这些信息应包括重复性和再现性数据，如果可用。如上所述，报告CVs为Cqs是不恰当的，因为Cqs常低于(因此可能误导)CVs计算的拷贝数量值。信息必须提供用于评价准确性的方法，包括组间差异的统计学意义。对于不同的需求我们选择不同的qPCR。
real-time Q-PCR 技术中，无论是相对定量还是
标准曲线定量方法仍存在一些 PCR 定量方法均有的问
题，有待解决。在标准曲线定量中，标准品的制备是一
个必不可少的过程。目前由于无统一标准，各个实验室
所用的生成标准曲线的样品各不相同，致使实验结果缺
乏可比性。此外，用 real-time Q-PCR 来研究 mRNA 时，
受到不同 RNA 样本存在不同的逆转录效率的限制。在相
对定量中，其前提是假设内源控制物不受实验条件的影
响，合理地选择合适的不受实验条件影响的内源控制物
也是实验结果可靠与否的关键。
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尽管在实验设计中，所涉及的荧光定量 PCR 仪 器操作步骤简单，且易于进行结果分析。但是，在采用 实时荧光定量 PCR 技术进行研究时，由于涉及的步骤 繁多，如从 RNA 样本制备、基因组或质粒 DNA 的去 除［12］，反转录 PCR 到内参基因的校准及操作者的试 验技术和所用试剂都会影响终结果。因此，在明确 研究目的之初，就应对整个研究项目进行合理的规划 设计。RNA 基因沉默技术是由于作用于同源序列 mRNA 的双链 RNA 所介导的序列特异性、转录后基因 沉默机制［13］。因其具有严格的序列特异性，基因调控 效果明确、的针对性强、副作用小等优点，所以，将 RNA 干扰技术应用于人类疾病的新方法备受关 注，已日益发展成研究基因功能和基因的有 力工具。上海SYBRGreen法qPCR服务
