qPCR有两化学方法——探针法和染料法，这位童鞋选择的是相对便宜的SYBR green染料法。但是偏有好事之徒指点江山，“为啥要做SYBRgreen染料法的qPCR呢？要做定量qPCR的话，不如做Taqman探针法的qPCR来得精确。有文章介绍过，SYBRgreen来做qPCR的话，是会有很严重问题的。因为SYBRgreen会抑制PCR反应，得出来的结果没有探针来的效果好，其实价钱也没差很多！”这位临床高手+实验室菜鸟，在他人的建议之下，开始转向研究Taqman探针，好不容易摸出点门道，准备将Taqman探针发给公司合成。实验室又出现另一个“好事之徒”，建议其直接检测乳腺疾病MCF-7细胞系Pim3蛋白表达量，理由如下：mRNA表达降低，并不表示蛋白表达会降低呢，因为如果蛋白的泛素化停滞，蛋白就会累积；又或者蛋白的磷酸化不断活跃，也会导致蛋白作用的变化。所以用Taqman探针还不如用WesternBlot来得直接，直接检测蛋白表达、磷酸化、泛素化的变化，以防后患。抗体的价钱也就比Taqman探针贵了那么一点而己。上海融享生物科技有限公司TaqMan探针法qPCR服务。陕西SYBRGreen法qPCR哪家好
扩增子是发生PCR反应的靶标基因片段。由于qPCR只是用于表征靶标基因的数量，并不需要得到其全长序列，因此扩增子区段的选择具有相当的灵活性，在基因读码框的内部即可（mRNA的分析除外）。区段的选择一般遵循以下原则：扩增子长度一般在75～200bp范围。如果太长，扩增效率会降低；而太短又无法与引物二聚体区分开。尽可能避免产生二级结构区域。这会极大的影响扩增效率。目前很多网站都可以在线预测二级结构，操作简单。尽可能避免了单碱基连续重复超过4次（如AAAA、CCCC等）。但有时在扩真核生物基因组时难以保证。GC含量尽可能在50%～60%。这一点在扩增某些物种（如放线菌）基因组时同样难以保证。高GC模板扩增需要加入一些特殊成分来优化实验，目前也有商品化的试剂。安徽SYBRGreen法qPCR哪家好实时荧光定量qPCR实验就找上海融享生物科技有限公司。
每个量化目标的校准曲线必须包含在提交稿件中，这些信息审稿人可以看到。校准曲线的斜率和Y截距必须包含在发表中。不同PCR效率可以产生不同的校准曲线和不同的斜率。因此靶基因和参考基因的Cq值不同可以保持不变，但是模板量是变化的，计算相对浓度是不准确的，易产生误导性结果。Cq＞40是可疑的，因为扩增效率低。使用这种Cq值是不理想的，因为它们可能太低(没有有效的结果)或者太高(假阳性结果增加)。反应的动态范围是线性的(比较高到比较低量化的拷贝数通过校准曲线表示)。根据生成校准曲线的模板，动态范围应当包括至少3个数量级，理想状态5或6log10浓度。校准曲线的线性间隔必须包括目标核酸量化的间隔。因为量化的低限常不明确，应当确定线性间隔内比较低浓度的变化。必须报道相关系数(r2值)，理想是CIs应当通过整个线性动态范围。
分析敏感性(Analyticalsensitivity)分析敏感性指实验准可以确测量样本的较小拷贝数，而临床敏感性(clinicalsensitivity)指实验可以确定患种疾病的阳性人数的百分比。通常灵敏度表示为检测限(limitofdetection,LOD)，即分析方法可以检测浓度的合理定性(常用95%的概率)。较敏感的LOD理论上可能是3拷贝/PCR，假设符合泊松分布，PCR有95%的可能性至少包含和检测到1个拷贝。实验步骤通常包括样本处理(如提取)，有时还需要反向转录过程。如果总量有变化，这些步骤的效率可以引起多数LOD敏感性变化，理论上表现在可能在与实验有关的单元上，如每克组织的拷贝数。不应报道实验结果少于理论上LOD可能性的结果。同样结果为「0」也是无意义和可引起误导的。因为当模板浓度是0时Cq是不确定的，在qPCR分析LOD的评估因Cq的对数而变得复杂。在qPCR中适当的确定和调节LOD是持续研究的重点。上海融享生物科技有限公司主营qPCR。
引物用于启始PCR反应，其质量直接关乎实验成败。引物设计一般遵循以下原则：长度在15～30bp（一般为18～25bp），GC含量尽可能在50%～60%。严重的比例失衡会导致引物二聚体增多。Tm值在50℃～65℃。过高会导致扩增受影响（DNA聚合酶有一定的工作温度范围）；过低容易产生错配，特异性差。目前很多软件和网站可以预测引物的Tm值，要注意的是该值（包括引物合成单中的Tm）只只是预测，并不表示实际情况，PCR时比较好的退火温度需要通过温度梯度实验来得到。避免匹配模板的二级结构区域。避免连续出现三个以上G或者C碱基。引物中碱基分布比较好是随机的，否则可能会在基因组中的GC密集区发生错误匹配。3’端尽量安置G或者C碱基。GC配对的强氢键作用对于启始PCR反应具有更好的作用。避免引物二聚体的出现。其中包括自身配对和上下游引物配对，这要求3’端序列尽可能不要出现大量碱基配对。 qPCR有两化学方法——探针法和染料法。四川TaqMan探针法qPCR电话
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扩增曲线异常，比如S型曲线参比染料设定不正确：MasterMix不加参比染料时，选NONE。模板的浓度太高或者降解。荧光染料的降解。定量PCR仪的开关机顺序是怎样的？按照正确的开关机顺序操作，有助于延长仪器的使用寿命，减少仪器出故障的频率。开机顺序：先开电脑，待电脑完全启动后再开启定量PCR仪主机，等主机面板上的绿灯亮后即可打开定量PCR的收集软件，进行实验。关机顺序：确认实验已经结束后，首先关闭信号收集软件，然后关掉定量PCR仪主机的电源，然后关闭电脑。陕西SYBRGreen法qPCR哪家好
