能否通过增加扩增循环数来增加试剂盒的敏感性？这里指的是大部分的qPCR试剂盒的循环数为40个或45个，我们能否在不改变试剂盒的设计的前提下，只通过将40个循环增加到45个循环，或是将临界值由38提高到40，或者由40提高到45的方式来提高试剂盒的敏感性呢？从原理上解释：理论上，假设初始模板量为1个拷贝，酶的扩增效率100%，到达比较大阈值约需要35个循环，因此业内通常认为qPCR的有效线性范围为Ct:15-35。通常酶的扩增效率无法达到100%，达到1个拷贝模板的循环数可能会达到38或更高，如下图我用qPCR和数字PCR测到了1拷贝模板对应的Ct值为37.91。当酶的效率更低或者存在抑制剂时，检测到1拷贝模板的循环数的Ct值可能会更高。qPCR 常见问题及分析。安徽SYBRGreen法qPCR机构
实时荧光定量 PCR双标准曲线即靶基因以及内参基因
各对应的一套标准曲线。假设靶基因的平均扩增效率为
E3， 在待测样品以及校准样品中的初始拷贝数分别为 N3 与 N4，当达到某一阈值时，该靶基因在待测样品以及校准样品
中检测到的 CT 值分别为 CT3 与 CT4，则有 C3·N3
·（1+E3）
CT3=C4· N4
·（1+E3）
CT4 （其中，C3 与 C4 分别为待测样品以及校准样品
的浓度），假设内参基因的平均扩增效率为 E4，内参基因在
待测样品以及校准样品中的初始拷贝数分别为 N3′与 N4′，
当达到某一阈值时，内参基因在待测样品以及校准样品中
检测到的 CT 值分别为 CT3′与 CT4′，则有 C3·N3′·（1+E4）
CT3′= C4·N4′·（1+E4）
CT4 ′，则靶基因与内参基因在待测样品中的拷贝
数比值 N3/N3′=N4/N4′·（（1+E3）
CT4-CT3 /（1+E4）
CT4 ′-CT3 ′
），其中，N4 为
靶基因在校准样品中的初始拷贝数，校准样品中靶基因的
拷贝数是已知的，并 且 是 经 过 Southern 杂 交 验 证的；N3′与 N4′是指内参基因在待测样品以及校准样品中的初始拷贝
数，在拷贝数变异检测中，内参基因需具有“同一物种内具
有恒定低拷贝”这一特点，也就是 N3′=N4′，故靶基因在待测
样品中的初始拷贝数 N3=N4
·（1+E3）
CT4-CT3 /（1+E4）
CT4 ′-CT3 ′。
河南SYBRGreen法qPCR机构电话SYBR荧光染料qPCR机构哪家靠谱？其实没有一项生物学实验是 so easy 的，即便是看起来毫无难度的 qPCR 。但同样地，任何一项生物学实验都是有套路的，包括 qPCR ，就看你套路深不深。对于像病毒载量这样的定量实验来讲，标准曲线的质量起到决定性作用。R2值太低一般是由于稀释操作不够准确，或者加样操作误差太大；E值太低则可能是由于探针引物设计不够好，或者Ta值不合适；而E值太高则提示可能出现了非特异扩增或者PCR扩增受抑制的情况。根据qPCR的MIQE准则，合适的扩增效率E在95%～105%，这就是努力的方向。很多人会有疑问，为啥要千方百计的优化扩增效率呢？扩增效率的提高可以提升qPCR检测体系的灵敏度、动态范围，减少非特异性产物的产生；数据的重复性及可信度也会得到提高；Tm值优化是提高扩增效率特别直接特别简单的方法，只需要一台具有温度梯度功能的qPCR设备即可，时间上还用不了半天。
Ct值能否作为评价qPCR试剂盒的指标？qPCR试剂的评价需要从分析敏感性（比较低检测限），分析特异性的（交叉反应），重复性（精密度），诊断敏感性，诊断特异性等多个指标去衡量（诊断试剂评价系列2-核酸检测方法（更正），诊断试剂评价系列4-比较低检测限，你做对了吗？）。只凭Ct值的高低去判断一个qPCR试剂盒的优劣太片面，不同试剂盒的Ct值不具有可比性。有些试剂盒采取先进行几个循环的预扩增，再进行正式循环的做法就是为了使Ct值看起来更低。上海qPCR推荐上海融享生物科技有限公司。
因此大量有关qPCR发表的文献中存在结果证据不足甚至是相互矛盾的结果，这对科学研究是一个很大的危险。科学文献的发表和撤回也为人们提出了警示。多数研究报告缺少足够的信息加剧了这个问题，使用qPCR的文献没有提供足够的实验细节，可以让读者评估结果的质量或者重复实验。具体表现为样本的采集和处理信息，RNA质量和完整性，反向转录细节，PCR效率，以及分析参数等等，这些信息常常被忽略，然而样本正规化是反对没有价值的单一参考基因。TaqMan荧光探针qPCR公司哪家好？吉林相对定量qPCR电话
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负对照有信号引物设计不够优化：应避免引物二聚体和发夹结构的出现。引物浓度不佳：适当降低引物的浓度，并注意上下游引物的浓度配比。镁离子浓度过高：适当降低镁离子浓度，或选择更合适的mix试剂盒。模板有基因组的污染：RNA提取过程中避免基因组DNA的引入，或通过引物设计避免非特异扩增。扩增效率低反应试剂中部分成分特别是荧光染料降解。反应条件不够优化：可适当降低退火温度或改为三步扩增法。反应体系中有PCR反应抑制物：一般是加入模板时所引入，应先把模板适度稀释，再加入反应体系中，减少抑制物的影响。安徽SYBRGreen法qPCR机构
