qPCR有两化学方法——探针法和染料法，这位童鞋选择的是相对便宜的SYBR green染料法。但是偏有好事之徒指点江山，“为啥要做SYBRgreen染料法的qPCR呢？要做定量qPCR的话，不如做Taqman探针法的qPCR来得精确。有文章介绍过，SYBRgreen来做qPCR的话，是会有很严重问题的。因为SYBRgreen会抑制PCR反应，得出来的结果没有探针来的效果好，其实价钱也没差很多！”这位临床高手+实验室菜鸟，在他人的建议之下，开始转向研究Taqman探针，好不容易摸出点门道，准备将Taqman探针发给公司合成。实验室又出现另一个“好事之徒”，建议其直接检测乳腺疾病MCF-7细胞系Pim3蛋白表达量，理由如下：mRNA表达降低，并不表示蛋白表达会降低呢，因为如果蛋白的泛素化停滞，蛋白就会累积；又或者蛋白的磷酸化不断活跃，也会导致蛋白作用的变化。所以用Taqman探针还不如用WesternBlot来得直接，直接检测蛋白表达、磷酸化、泛素化的变化，以防后患。抗体的价钱也就比Taqman探针贵了那么一点而己。qPCR的多种项目总有一款是您满意。吉林TaqMan荧光探针qPCR哪家好
Ct值与模板拷贝数的关系：理想情况下，qPCR的模板经过一定的循环数进行指数扩增，扩增循环数和产物量之间的关系是：扩增产物量Cn=起始模板量C1×（1+扩增效率E）^循环数n。但是由于E通常无法达到100%，并且在扩增的后期，扩增效率会逐渐降低，只有在理想的情况下才满足Cn=C1×2^n，即Ct值差1，初始浓度差2倍。由于Ct值与起始模板的对数存在线性关系，可利用标准曲线对未知样品进行定量测定。这是目前较常用的qPCR定量的方法，即用已知浓度的标准品与未知浓度样品同时扩增，将未知浓度样品的Ct值代入该标准曲线获得未知样品浓度。分析定量时，一般取Ct:15-35。太大或者太小都会导致定量结果的不准确。标准曲线需满足：E：90%~110%，R^2≥0.99，斜率-3.58~-3.10。同时定量标准品的量值需要准确可靠。用qPCR进行定量，理论上可行，实际上很难获得准确的定量结果。云南相对定量qPCRqPCR的特点成为了一个重要因素。
扩增子是发生PCR反应的靶标基因片段。由于qPCR只是用于表征靶标基因的数量，并不需要得到其全长序列，因此扩增子区段的选择具有相当的灵活性，在基因读码框的内部即可（mRNA的分析除外）。区段的选择一般遵循以下原则：扩增子长度一般在75～200bp范围。如果太长，扩增效率会降低；而太短又无法与引物二聚体区分开。尽可能避免产生二级结构区域。这会极大的影响扩增效率。目前很多网站都可以在线预测二级结构，操作简单。尽可能避免了单碱基连续重复超过4次（如AAAA、CCCC等）。但有时在扩真核生物基因组时难以保证。GC含量尽可能在50%～60%。这一点在扩增某些物种（如放线菌）基因组时同样难以保证。高GC模板扩增需要加入一些特殊成分来优化实验，目前也有商品化的试剂。
与Ct值有关的参数：标准曲线Standardcurve：模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标表示起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值。相关系数Correlationcoefficient(R^2)：反映了标准曲线的线性，通常要求>0.99。扩增效率Efficiency(E):通常要求在90%~110%。效率低于100%，是由于PCR反应中存在抑制因素；而高于100%可能一些污染、非特异性扩增或者是引物二聚体造成。斜率 Slope ：当扩增效率为 100% 时斜率为 - 3.32，当 90%-110% 时的斜率为 - 3.58 ~ -3.10。上海SYBRGreen法qPCR机构哪家靠谱？
以下信息qPCR试验必须提供的：数据库登陆每个靶基因和参考基因的数目，每个引物和任何探针的外显子位点，每个寡核苷酸的浓度和序列，包括性质、位点和结合任何染料和/或修饰碱基。同样需要聚合酶的名称和浓度，每个反应的模板(DNA或RNA)数量，Mg2+浓度，缓冲液中确切化学组成(盐、PH值、添加剂)，以及反应量。研究人员还必须确认他们所使用的仪器，所有PCR循环条件的文件。因为所使用的耗材影响热循环，必须确定使用单一试管、带或者板，以及它们的制造商。所使用的塑料制品的透明度，如白色或者透明，这也重要，因为不同的塑料的荧光反射敏感性不同。当使用板时，密封(热粘合或粘合剂)的方法可以影响板周边样品的蒸发，这也要记录。因为PCR效能高度依赖于所使用的引物，因此引物的序列必须发表。这个要求是完全可行的，甚至是商业性的引物，因为有先例。另外强烈建议提交给公共数据库，如RTprimerDB，这些数据库可以成为通用的交换所。qPCR的好处您知道么？江苏qPCR公司
SYBR green染料法相对较便宜。吉林TaqMan荧光探针qPCR哪家好
稳定和精确的qPCR实验常和PCR效率有关。当靶基因相对于参考基因的mRNA浓度时PCR的效率特别重要。△△Cq法是基于单一参考基因的标准化当下流行确定不同浓度样本的差异性的方法。计算靶基因和参考基因Cq值(△Cq)的差异，直接比较不同样本△Cqs。扩增两个基因以比较这两个基因的效率。但是当下流行的方法不一定是较合适的，不过现在已开发替代的定量模型用于纠正扩增效率，还可以使用多个参考基因。PCR扩增效率必须建立校准曲线，因为这种校准提供了一个简单、快速以及可重复PCR效率、分析敏感性和实验的稳定性的平均指标。效率放大应当从l校准曲线的og线性部分的斜坡部分决定。具体而言PCR效率＝10-1/slop-1，初始模板浓度的对数(单独变量)是X轴，Cq(依赖变量)是Y轴。理论较大值为1.00(或100%)表示每个周期的产物量加倍。理想状态下PCR的估计平均效率的CIs或SEs服从校准曲线。吉林TaqMan荧光探针qPCR哪家好
