Ct 会受到阈值的影响，每次试验由于样品和仪器的不同会导致基线不同，进而影响阈值和 Ct 值。模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在一定线性关系，起始模板量浓度越高，Ct值越小；起始模板量浓度越低，Ct值越大。PCR循环在到达Ct值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期（对数期），此时微小误差尚未放大，Ct值的重现性较好，即相同含量的初始模板，得到的Ct值是相对稳定的。Ct值不是恒定不变的，可以受到不同样品、不同仪器的影响，即使相同的样品在相同的仪器上重复2遍，Ct值也会存在差异。qPCR的特点成为了一个重要因素。辽宁SYBR荧光染料qPCR机构电话
Ct值出现过晚（Ct>38）扩增效率低：反应条件不够优化。设计更好的引物或探针；改用三步法进行反应；适当降低退火温度；增加镁离子浓度等。PCR各种反应成分的降解或加样量的不足。PCR产物太长：一般采用80～150bp的产物长度。标准曲线线性关系不佳加样存在误差：使得标准品不呈梯度。标准品出现降解：应避免标准品反复冻融，或重新制备并稀释标准品。引物或探针不佳：重新设计更好的引物和探针。模板中存在抑制物，或模板浓度过高。江苏TaqMan荧光探针qPCR机构哪家好上海TaqMan荧光探针qPCR公司哪家靠谱？
什么是CT值比较法？数据怎么处理？CT值与起始DNA浓度的对数成反比：如果：不同管之间的PCR反应效率相同。这些PCR的反应效率接近100%。可以从上面的公式推出相对含量（X01/X02）=2-ΔCT。假设实验的目标是研究药物处理后0、24、48小时IL-2基因在某种组织中的表达量的变化，所用内对照是18SRNA基因。IL-2和18SRNA的测定结果都是CT值，而没有通过标准曲线测定总RNA的pg数。内标法和外标法哪种数据更精密？是同样可靠的。内标的优点在于目标基因与管家基因的反应条件较接近一致，缺点在于目标基因与管家基因的引物和探针相互之间会发生竞争与抑制，导致它们的PCR效率有差异。外标的优点在于目标基因与管家基因的引物和探针之间没有发生竞争与抑制的机会，但是不同管之间的反应条件差异比同管的要大，也会导致它们的PCR效率有差异。两相比较，内标法与外标法的数据精确度是一样的。
怎样判断定量pcr仪的样本加热块是否被污染？怎样清理污染？一个办法是运行背景校正反应板，当一个或多个反应孔连续显示出不正常的高信号，则表明该孔可能被荧光污染物。另外一种办法是在不放任何物品到样本块上的前提下，执行ROI的校正，当某个孔的信号明显高出其他孔时，则表明该孔被污染。清理样本加热块污染的步骤如下：用移液器吸取少量乙醇并滴入每个污染的反应孔中。吹打数次。将废液吸入废液杯中。重复以上步骤：乙醇三次，去离子水三次。确认反应孔中的残留液体蒸发完。qPCR的优势有些什么？
RNA模板的质量评估也是必不可少的，专有例外当提取的总RNA质量太低以至于不能评价质量时。这种情况一般发生在从单一细胞、血浆或其它体液中提取RNA，以及一些激光捕获样本或者组织培养收集的样本提取RNA时。这种情况同样适用于RT-qPCR持续单管试验。需要报道RNA数量，融合和没有反转录或PCR抑制剂等关键信息。应该记住体内RNA降解是由于mRNA因自然刺激的自然调节。RNA降解是研究人员无法控制的，其表现之一是高质量的RNA样本可以表现单个mRNAs的不同降解。A260/A280比值必须在中性PH值buffer中测量，但是这个比值如果于核酸用于定量分析，尤其是目的是为了测量细胞mRNA浓度的微小差异(＜10倍)时，这个比值不够用。吸收度比值提供了RNA纯度指标，因为DN或者残余苯酚可以改变这个比率。因此至少应该提供凝胶电泳证据，或者更好能提供微流控芯片的rRNA分析结果，或者一个参考基因/靶基因3’:5’完整性检测。SYBR green染料法相对较便宜。甘肃相对定量qPCR机构电话
对于不同的需求我们选择不同的qPCR。辽宁SYBR荧光染料qPCR机构电话
完整的探针包括荧光基团、淬灭基团和寡核苷酸序列三部分，理想的探针应该具有特异性高、荧光本底低等特点。对于寡核苷酸序列的设计一般遵循以下原则：GC含量30%～80%，C碱基要多于G碱基，长度一般15～30bp。过长会影响淬灭效率，导致荧光本底较高；过短则导致特异性下降。Tm值一般比引物的要高5～10℃。5’端不能安置G碱基。G碱基本身具有荧光淬灭的特性，会导致荧光基团被切掉后也无法发出荧光。荧光基团根据检测的多重性灵活选择，一般优先常规的 FAM 和 HEX，同时针对不同的荧光基团选择合适的淬灭基团。辽宁SYBR荧光染料qPCR机构电话
