减少或消除非特异性染色的方法 组织中非抗原抗体反应出现的阳性染色称为非特异性背景染色，较好常见的原因是蛋白吸附于高电荷的胶元和结缔组织成分上。有效方法是在用首先抗体前加制备第二抗体动物之非免疫血清（1：5-1：20）封闭组织上带电荷基团而除去与首先抗体非特异性结合。必要时可加入2%-5%牛血清白蛋白，可进一步减少非特异性染色。作用时间为10-20min。也可用除制备首先抗体以外的其它动物血清（非免疫的）。有明显溶血的血清不能用，以免产生非特异性染色。免疫荧光染色时，可用0.01%伊文氏兰(PBS溶液)稀释荧光抗体,对消除背景的非特异性荧光染色有很好的效果。当然使用特异性高、效价高的首先抗体是较好重要的条件。洗涤用的缓冲液中加入0.85%~1%NaCl成为高盐溶液,充分洗涤切片,能有效的减少非特异性结合而减少背景染色。免疫组化找上海融享生物科技有限公司。江西免疫组化实验
5．滴加抗体，4℃过液或室温5′~1hour。6．，洗三次，每次5分钟。7．滴加第二抗体，室温15′~60′。8．洗净，洗三次，每次5分钟。9．滴加ABC复合物，室温15~60分钟。10．洗三次，每次5分钟。11．Tris–HCL5~10分钟，此步可省略。12．DAB—H2O2显色：用，室温5~30分钟，随时镜检（DAB用时新配）13．自来水洗净。14．用Mayer苏木素或甲基绿，复染胞核（可不染）。15．常规脱水、透明、封固、镜检。结果：棕褐色反应产物**抗原X的定位。免疫组化染色基本技术及注意事项1．实验计划①根据课题的内容选用动物，选用配套的Ab。如Ab—I鼠抗人的抗体，与其他种属间无交叉，则不能用其他动物，而且Ab-Ⅱ必须是羊抗鼠，若***法Ab-Ⅲ必须来源于鼠，否则不能连接成复合物。②若要比较染色深浅在对照组与实验组间的差异，在贴片方面较好贴于同一张载片上，否则无可比性。③选用的试剂可靠，货源充足，随时可取。2．Ab稀释度（如系购买的药盒有工作液和原液）（1）工作液：无须稀释（2）原液：①应参照其提供的工作液浓度进行预试验验。如：工作液浓度为1∶1000，可选1∶500，1∶1000，1∶1500试验；若:1∶500有背景，1∶1000阳性反应稍浅，可选1∶750进行试验。②原液的保存。江西IHC免疫组化实验上海免疫组化，免疫荧光性价比找融享生物高效率周期快。
免疫组化，是应用免疫学基本原理—抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及相对定量的研究，称为免疫组织化学技术或免疫细胞化学技术。免疫组化，是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及相对定量的研究，称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry)。
（1）ABC复合物的制备：（2）ABC法反应原理6．SP或SAP法（过氧化物酶标记的链霉卵白素或过氧化物酶标记的碱性磷酸酶染色）Streptavidin/peroxidaseorstrepta-vidin/alkalinephosphatase）※该法是ABC法基础上的进一步改良，使卵白素与链霉（而非生物素）结合，而后再结合PO。它有4个亚基可与生物素结合，灵敏特异，背景低，成本低。现在还有plus盒。优点是：更简便，放大倍数↑，等电点中性更适合组织。分子量小，穿透力↑。7．蛋白A—金法（Protein—Agoldmethod）~多用于电镜8．双重组化染色法应用双重免疫组织化学可在同一张切片，同一细胞或亚细胞结构内同时显示两种不同的抗原。9．免疫金—银染色法（Immunogold—silverstainingIGSS）固定——见前述注意事项：1．固定剂的选择：因组织而不同，注意质量和性能。2．固定方式的选择：①浸渍固定（参考文献）②灌注固定（+后固定）③蒸汽固定免疫组化染色步骤（以ABC法为例）1．切片脱蜡入水，入PBS洗三次/15分钟。2．封闭内源性过氧化物酶。用新配置的（在PAS或—HCL缓冲液）室温，30分钟。3．水洗，入PBS，洗三次，每次5分钟。4．减少非特异性着色用稀释20倍的正常血清（产生二次抗体动物血清！），室温，30分钟。上海融享生物做免疫组化，HE染色，免疫荧光。
基本原理编辑
抗体和抗原之间的结合具有高度的特异性，免疫组织化学正是利用了这一原理。先将组织或细胞中的某种化学物质提取出来，以此作为抗原或半抗原，通过免疫动物后获得特异性的抗体，再以此抗体去探测组织或细胞中的同类的抗原物质。由于抗原与抗体的复合物是无色的，因此还必须借助于组织化学的方法将抗原抗体结合的部位显示出来，以期达到对组织或细胞中的未知抗原进行定性，定位或定量的研究。分类编辑
免疫组织化学技术按照标记物的种类可分为免疫荧光法、免疫酶法、免疫铁蛋白法、免疫金法及放射免疫自显影法等。
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拍照
有条件的话比较好立即拍照，若不能及时拍照，也要封好片和用指甲油封固，保持避光和湿度。使用荧光显微镜注意严格按照荧光显微镜出厂说明书要求进行操作，不要随意改变程序;应在暗室中进行检查;防止紫外线对眼睛的损害，在调整光源时应戴上防护眼镜;检查时间每次以1~2h为宜，超过90min，超高压汞灯发光强度逐渐下降，荧光减弱;标本受紫外线照射3~5min后，荧光也明显减弱或褪色;激发光长时间的照射，会发生荧光的衰减和淬灭现象;所以较多不得超过2~3h;荧光显微镜光源寿命有限，标本应集中检查，以节省时间，保护光源。天热时，应加电扇散热降温，新换灯泡应从开始就记录使用时间。灯熄灭后欲再启用时，须待灯光充分冷却后才能点燃。天中应避免数次点燃光源。关闭汞灯至少在开启15-30分钟后;标本染色后立即观察，因时间久了荧光会逐渐减弱。若将标本放在聚乙烯塑料袋中4℃保存，可延缓荧光减弱时间，防止封裱剂蒸发;使用的玻片等载体，都必须厚度均匀，无明显的自发荧光，如果使用油镜，还必须保证镜油为无荧光镜油;电源比较好装稳压器，否则电压不稳不只会降低汞灯的寿命，也会影响镜检的效果。
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