5．滴加抗体，4℃过液或室温5′~1hour。6．，洗三次，每次5分钟。7．滴加第二抗体，室温15′~60′。8．洗净，洗三次，每次5分钟。9．滴加ABC复合物，室温15~60分钟。10．洗三次，每次5分钟。11．Tris–HCL5~10分钟，此步可省略。12．DAB—H2O2显色：用，室温5~30分钟，随时镜检（DAB用时新配）13．自来水洗净。14．用Mayer苏木素或甲基绿，复染胞核（可不染）。15．常规脱水、透明、封固、镜检。结果：棕褐色反应产物**抗原X的定位。免疫组化染色基本技术及注意事项1．实验计划①根据课题的内容选用动物，选用配套的Ab。如Ab—I鼠抗人的抗体，与其他种属间无交叉，则不能用其他动物，而且Ab-Ⅱ必须是羊抗鼠，若***法Ab-Ⅲ必须来源于鼠，否则不能连接成复合物。②若要比较染色深浅在对照组与实验组间的差异，在贴片方面较好贴于同一张载片上，否则无可比性。③选用的试剂可靠，货源充足，随时可取。2．Ab稀释度（如系购买的药盒有工作液和原液）（1）工作液：无须稀释（2）原液：①应参照其提供的工作液浓度进行预试验验。如：工作液浓度为1∶1000，可选1∶500，1∶1000，1∶1500试验；若:1∶500有背景，1∶1000阳性反应稍浅，可选1∶750进行试验。②原液的保存。上海融享生物做各类病理实验 免疫荧光,HE染色服务实验等服务。黑龙江特殊染色免疫组化公司电话
阴性染色产生的原因有:
⑴一抗和二抗浓度不合适或孵育条件不妥。
⑵荧光素提前衰退。荧光素质量不佳或操作过程中没有注意避光等防止荧光素衰退的事项。
⑶血清封闭时间过长。
⑷抗体稀释液PH值不合适，影响抗原抗体反应。
⑸组织切片不平、裂片或脱片很严重，易引起大块阴性着色。
⑹组织标本不新鲜或已经冷冻组织制成的切片中抗原易弥散，易引起本来表达的部位阴性染色或弱着色。
⑺荧光显微镜不会使用，激发波长选择错误。
免疫组化，是应用免疫学基本原理--抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素)显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及相对定量的研究，称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry)。 黑龙江荧光免疫组化实验有关免疫组化，HE染色，免疫荧光服务就找融享生物。
免疫组化技术是利用已知的特异性抗体或抗原特异性结合的特点，通过化学反应使标记于结合后的特异性抗体上的显示剂通过借助显微镜的观察，从而在抗原抗体结合部位确定组织细胞结构的一门组化技术。在病理诊断、基础医学研究工作中免疫组化技术已成为非常重要的手段。免疫组化显色是一种酶促反应，它通过连结在抗原抗体复合物上的过氧化物酶或碱性磷酸酶与底物DAB发生反应，生成有色的复合物沉淀在组织细胞中的抗原部位。由于标本组织来源不同，细胞分化不一，抗原含量不等，显色反应所需时间不可能完全一致。整个免疫组化过程步骤较多，每步应按操作要求严格操作，脱蜡一定要充分。每步PBS冲洗时间、次数一定不能省略，因PBS液内含有盐，
好坏有着密切的联系。由于各种抗原的生化、物理性质不同，如温度高低、酸碱度强弱及各种化学试剂的作用均可影响抗原的免疫学活性，良好的细胞和组织学结构将有助于抗原的准确定位。因此，细胞和组织标本的采集制备在免疫组织化学技术中占有十分重要的位置。（一）细胞标本的取材目前，免疫组化技术已经应用于细胞学诊断，如鉴别低分化*与恶性淋巴瘤、黑色素瘤、低分化肉瘤等。CEA应用于胸腹水中间皮瘤与*的鉴别，热修复法 现常用微波修复、高温高压修复、水浴加热修复法。较常用的修复法是pH6.0枸橼酸缓冲液。修复过程中的注意要点是:（1）达到规定的温度（92℃～95℃以上）;（2）维持一定的时间，微波修复、水浴加热须控制在10～15min，高温高压修复须控制在2min左右;（3）避免切片干涸，如果切片干涸，抗原则可能完全丢失;（4）加热后必须经过室温自然冷却20～30min，使未折叠的蛋白分子链恢复天然构型。免疫组化专业技术比较好的公司找融享生物。
意义编辑
近年来，随着免疫组织化学技术的发展和各种特异性抗体的出现，使许多疑难得到了明确诊断。在常规病理诊断中，5%-10%的病例单靠H.E.染色难以作出明确的形态学诊断。尤其是免疫组化在诊断和鉴别诊断中的实用价值受到了普遍的认可，其在低分化或未分化的鉴别诊断时，准确率可达50%-75%。免疫组织化学的临床应用主要包括以下几方面：
⑴恶性的诊断与鉴别诊断；
⑵确定转移性恶性的原发部位；
⑶对某类进行进一步的病理分型；
⑷软组织的一般需根据正确的组织学分类，因其种类多、组织形态相像，有时难以区分其组织来源，应用多种标志进行免疫组化研究对软组织的诊断是不可缺少的；
⑸发现微小转移灶，有助于临床方案的确定，包括手术范围的确定。
⑹为临床提供方案的选择。
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根据标记物的不同，免疫细胞化学技术可分为免疫荧光细胞化学技术，免疫酶细胞化学技术，免疫铁蛋白技术，免疫金-银细胞化学技术，亲和免疫细胞化学技术，免疫电子显微镜技术等。近些年来，核酸分子原位杂交技术采用生物素、地高辛等非放射性物质标记探针，和免疫细胞化学技术密切结合，发展为杂交免疫细胞化学技术。不同的免疫细胞化学技术，各具有独特的试剂和方法，但其基本技术方法是相似的，都包括抗休的制备，组织材料的处理、免疫染色、对照试验、显微镜观察等步骤。还有双重和多重标记技术也有重要的用途。黑龙江特殊染色免疫组化公司电话
