广东拷贝数变异数字PCR售后分析

数字PCR即Digital PCR（dPCR)，是一种核酸分子***定量技术。数字PCR是一种基于单分子快速PCR扩增，进行核酸拷贝数定量的一种方法。数字PCR( 也可称单分子PCR) 一般包括两部分内容，即PCR 扩增和荧光信号分析。在PCR 扩增阶段，与传统技术不同，数字PCR 一般需要将样品稀释到单分子水平，并平均分配到几十至几万个单元中进行反应。不同于qPCR对每个循环进行实时荧光测定的方法，数字PCR 技术是在扩增结束后对每个反应单元的荧光信号进行采集。***通过直接计数或泊松分布公式计算得到样品的原始浓度或含量。转基因食品或成分的检测。广东拷贝数变异数字PCR售后分析

***代PCR技术是常规PCR技术，对目的基因扩增后进行凝胶电泳，将扩增条带与已知浓度的标准品比较，得到定性结果，但在产物分析时需要开盖操作，容易引起交叉污染，导致假阳性。第二代PCR技术是在PCR反应体系加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR反应进程，通过相关数据分析方法对目的基因进行定量分析的技术。数字PCR是第三代PCR技术，是一种采用微流控或微滴化的方法将稀释后的待测样品核酸溶液分散至微反应器或微滴中再在相同条件下进行单分子PCR，检测每一个微反应器或微滴中荧光信号通过直接计数或泊松分布修正得到原始浓度或含量的核酸分子***定量技术。目前大致可分为三类：微反应室/孔板数字PCR、大规模集成微流控芯片数字PCR、液滴数字PCR。四川重现性数字PCR经验丰富增加引物或探针的Tm值，从而实现更短的引物和探针设计。

ddPCR主要有Bio-rad公司开发的QX200系统和Rain Drop系统，QX200可以将体系分割成2万个微滴，Rain Drop可以分割成100万-1 000万个微滴。ddPCR原理是通过将一个待分析的PCR反应体系进行微滴化处理，利用微滴发生器制成近20 000个油包水小微滴从而对原始体系进行分割，样品中的核酸分子随机分配到大量**的微滴中，每个微滴中含有一个或不含待检核酸分子。对微滴体系进行扩增反应以后，分析每个微滴的荧光信号，进行有或无的判断，将判断结果按照泊松分布的原理，通过读取靶标和内参核酸的阳性微滴个数以及比例从而得到靶分子的拷贝数及浓度。与芯片式dPCR相比，操作简单，可以实现高通量的检测，也保证一定程度上的微滴检测稳定性。

可以使用几种不同的方法来分配样品，包括微孔板，毛细管，油乳剂和带有核酸结合表面的小型化腔室阵列。样品的分配使人们可以通过假设分子种群遵循泊松分布来估计不同分子的数量，根据泊松分布的原理，反应体系中目标分子的拷贝数可以通过公式A=-ln[(N-X)/N]*N计算，从而解决了多个目标分子存在于单个液滴中的可能性。同时，从公式也可以看出，随着反应阳性体系数（X）的增加，体系中目标分子的拷贝数相对于X会有较大的差距，随着X的持续增加，数字PCR结果的不确定度也随着提高，总体来说，数字PCR阳性体系的数量不得超过总体系数量的80%。另一个方面，N的增加会使整个数字PCR体系具有较大的线性范围，并可以提高反应的灵敏度、稳定性以及可重复性。因此，目前dPCR都需要在成本可控的情况下，增加分配的腔室数和液滴数。对模板量要求高，过多会导致无法定量，过少会导致信号过低。

微小残留病变（minimalresidualdisease，MRD）：随着化疗、靶向***、造血干细胞移植等***方式的改进，血液**的***效果日益改善。微小残留病（MRD）导致的复发是目前血液*****的一大难题。动态监测MRD对于评价***疗效、预测疾病复发、实施个体化***具有重要的指导意义。MRD检测方法需满足可定量、标准化、便捷性的要求。目前**常见的是流式细胞学（flowcytometry,FCM）和PCR两大类,但只有灵敏度高于10-4才能被纳入标准化评估。数字PCR技术，其有限稀释的特点可降低复杂的背景干扰，浓缩低丰度目的基因信号，从而提高MRD检测的灵敏度。在慢性髓系白血病中，Wang等同时用dPCR和qPCR检测了61名CML患者的外周血，这些患者在每3个月一次连续3次的qPCR检测中，已经检测不到BCR-ABL，dPCR检测到18%的患者是阳性的。在随后的随访中，dPCR能比qPCR提前几个月检测到BCR-ABL的升高。在淋系白血病的BCL2-IGHMBR检测中，Drandi等在222例样本中验证了dPCR和qPCR方法的一致性，还成功地将dPCR应用于3例qPCR无法检测的病例。数字PCR作为目前灵敏度和准确性比较高的分子检测方法，非常适用于微小残留病变评估。数字PCR技术为基因表达分析提供了高精确的定量分析方法。天津高灵敏度数字PCR经验丰富

DNA聚合酶对实验的准确性起着至关重要的作用。广东拷贝数变异数字PCR售后分析

PCR扩增效率的高低直接影响**终信号的判读和实验结果分析。在进行热循环实验时，需检查样品的密封性以及PCR反应板是否和PCR仪热盖完全接触，确保PCR过程中样品反应液没有蒸发。QIAcuity数字PCR系统采用**的微反应腔室封闭方式，固态的物理分割和封闭可有效避免PCR过程中微反应体系的水分蒸发，确保微反应体系中样本反应液浓度的恒定，更易实现准确和精确的定量。原始数据中往往发现阳性信号与阴性背景之间存在许多弱阳性信号。因此需要对引物探针进行重新设计和优化（详见引物探针优化设计）或提升退火温度（探针通常比引物高5~10℃），以消除疑似荧光信号的“雨区“现象；此外，阳性信号和阴性背景间隙过小，导致**终结果无法准确判读。因此需要调整引物探针浓度（建议总反应体系引物浓度为600~800nM；探针浓度为200-400nM）或5' 端**个碱基如有G出现，则将其互补序列设计为实验所用探针，以提高阴阳性信号间隙，便于分析结果的准确判读。广东拷贝数变异数字PCR售后分析