做RT-qPCR实验时，大家常常会遇到各种各样的问题，如扩增曲线异常，熔解曲线异常，复孔重复性差，Ct值偏大等，其中Ct值偏大可能是大家较容易遇到的问题。现在就给大家分享下，遇到Ct值偏大问题时该如何解决。RT-qPCR的Ct值偏大主要有两种情况，一种是所有基因Ct都偏大，另外一种是个别基因Ct偏大。所有基因Ct偏大：如果前期所做基因均已做过预实验，Ct值正常，而本次实验，所有基因扩增Ct值都偏大，那很可能是模板质量的原因，如发生了降解，浓度不纯等。可通过Nanodrop和琼脂糖凝胶电泳实验评估RNA的质量，包括浓度、纯度及完整度。上海融享生物科技有限公司SYBRGreen法qPCR服务。云南qPCR机构哪里有
能否通过增加扩增循环数来增加试剂盒的敏感性？这里指的是大部分的qPCR试剂盒的循环数为40个或45个，我们能否在不改变试剂盒的设计的前提下，只通过将40个循环增加到45个循环，或是将临界值由38提高到40，或者由40提高到45的方式来提高试剂盒的敏感性呢？从原理上解释：理论上，假设初始模板量为1个拷贝，酶的扩增效率100%，到达比较大阈值约需要35个循环，因此业内通常认为qPCR的有效线性范围为Ct:15-35。通常酶的扩增效率无法达到100%，达到1个拷贝模板的循环数可能会达到38或更高，如下图我用qPCR和数字PCR测到了1拷贝模板对应的Ct值为37.91。当酶的效率更低或者存在抑制剂时，检测到1拷贝模板的循环数的Ct值可能会更高。海南TaqMan探针法qPCR哪里有上海SYBR荧光染料qPCR机构哪家好？
其实没有一项生物学实验是 so easy 的，即便是看起来毫无难度的 qPCR 。但同样地，任何一项生物学实验都是有套路的，包括 qPCR ，就看你套路深不深。对于像病毒载量这样的定量实验来讲，标准曲线的质量起到决定性作用。R2值太低一般是由于稀释操作不够准确，或者加样操作误差太大；E值太低则可能是由于探针引物设计不够好，或者Ta值不合适；而E值太高则提示可能出现了非特异扩增或者PCR扩增受抑制的情况。根据qPCR的MIQE准则，合适的扩增效率E在95%～105%，这就是努力的方向。很多人会有疑问，为啥要千方百计的优化扩增效率呢？扩增效率的提高可以提升qPCR检测体系的灵敏度、动态范围，减少非特异性产物的产生；数据的重复性及可信度也会得到提高；Tm值优化是提高扩增效率特别直接特别简单的方法，只需要一台具有温度梯度功能的qPCR设备即可，时间上还用不了半天。
使用Bioanalyzer/Experion系统计算RNA完整性数量或RNA质量指标数量的优点是这些指标可以提供有关RNA样本一般状态的定量信息。但是要记住这些与rRNA质量有关的数字不能期望作为质量的指标。使用3’:5’分析要求两个实验的PCR效率几乎相同，不受不同抑制剂的控制。这个实验还需要一个阈值来定义RNA质量产量不足可信结果。理想状太下检测目标是一组「可靠参考基因」，可能没有内含子，3’:5’的倍数大约是0.2-5。显然需要进一步的工作开发一个评价RNA完整性的工具，既有普遍适用性，又有成本效益和操作简单。应当通过稀释样本(比较好)检测反转录活性或者PCR抑制剂，或者使用一般的抑制试验如SPUD。如果RNA样本部分降解，这个信息必须报道，因为实验的低水平转录检测敏感性可能减少，转录的降解的相对差异可能引起不正确的比率。用qPCR检测细胞内mRNA的表达量。
试验结果：（1）比较低检测限：40个循环和45个循环的比较低检测限均为3copies/μL；（2）低浓度模板的阳性检出率：2，1，0.5copies/μL的阳性检出率完全相同，分别为90%，70%，60%；（3）平均值，SD，CV：将两者平均值做配对T检验的P值为0.002，差异极明显，45个循环的平均值普遍比40个循环的平均值高0.35-1.22，而SD和CV均无明显性差异。（4）Ct值40以上的结果：只有一个值为40.53。试验结论：通过增加循环数不能提高试剂本身的比较低检测限和对低浓度样品的检出率。循环数增加是否会增加非特异扩增的概率，本次试验未进行验证。上海qPCR公司哪家好？云南TaqMan荧光探针qPCR实验
上海融享生物科技有限公司相对定量qPCR服务。云南qPCR机构哪里有
每个量化目标的校准曲线必须包含在提交稿件中，这些信息审稿人可以看到。校准曲线的斜率和Y截距必须包含在发表中。不同PCR效率可以产生不同的校准曲线和不同的斜率。因此靶基因和参考基因的Cq值不同可以保持不变，但是模板量是变化的，计算相对浓度是不准确的，易产生误导性结果。Cq＞40是可疑的，因为扩增效率低。使用这种Cq值是不理想的，因为它们可能太低(没有有效的结果)或者太高(假阳性结果增加)。反应的动态范围是线性的(比较高到比较低量化的拷贝数通过校准曲线表示)。根据生成校准曲线的模板，动态范围应当包括至少3个数量级，理想状态5或6log10浓度。校准曲线的线性间隔必须包括目标核酸量化的间隔。因为量化的低限常不明确，应当确定线性间隔内比较低浓度的变化。必须报道相关系数(r2值)，理想是CIs应当通过整个线性动态范围。云南qPCR机构哪里有
