通常来讲，real-timeqPCR的反应程序不需要像常规的PCR那样，要变性、退火、延伸3步。由于其产物长度在80～150bp之间，所以只需要变性和退火就可以了。SYBR@Green等染料法，比较好在PCR扩增程序结束后，加一个溶解程序，来形成溶解曲线，判断PCR产物的特异性扩增。而溶解程序，仪器都有默认设置，或稍有不同，但都是一个在产物进行溶解时候，进行荧光信号的收集。现在给大家汇总一下qPCR常见问题。无Ct值出现检测荧光信号的步骤有误：一般SG法采用72℃延伸时采集，Taqman法则一般在退火结束时或延伸结束采集信号。引物或探针降解：可通过PAGE电泳检测其完整性。模板量不足：对未知浓度的样品应从系列稀释样本的比较高浓度做起。模板降解：避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况。TaqMan荧光探针qPCR公司哪家好？河南相对定量qPCR哪里有
引物用于启始PCR反应，其质量直接关乎实验成败。引物设计一般遵循以下原则：长度在15～30bp（一般为18～25bp），GC含量尽可能在50%～60%。严重的比例失衡会导致引物二聚体增多。Tm值在50℃～65℃。过高会导致扩增受影响（DNA聚合酶有一定的工作温度范围）；过低容易产生错配，特异性差。目前很多软件和网站可以预测引物的Tm值，要注意的是该值（包括引物合成单中的Tm）只只是预测，并不表示实际情况，PCR时比较好的退火温度需要通过温度梯度实验来得到。避免匹配模板的二级结构区域。避免连续出现三个以上G或者C碱基。引物中碱基分布比较好是随机的，否则可能会在基因组中的GC密集区发生错误匹配。3’端尽量安置G或者C碱基。GC配对的强氢键作用对于启始PCR反应具有更好的作用。避免引物二聚体的出现。其中包括自身配对和上下游引物配对，这要求3’端序列尽可能不要出现大量碱基配对。 广西TaqMan荧光探针qPCR机构哪里有一个 qPCR 试剂盒的重心是引物探针设计、酶、反应体系和较好的反应条件。
扩增子是发生PCR反应的靶标基因片段。由于qPCR只是用于表征靶标基因的数量，并不需要得到其全长序列，因此扩增子区段的选择具有相当的灵活性，在基因读码框的内部即可（mRNA的分析除外）。区段的选择一般遵循以下原则：扩增子长度一般在75～200bp范围。如果太长，扩增效率会降低；而太短又无法与引物二聚体区分开。尽可能避免产生二级结构区域。这会极大的影响扩增效率。目前很多网站都可以在线预测二级结构，操作简单。尽可能避免了单碱基连续重复超过4次（如AAAA、CCCC等）。但有时在扩真核生物基因组时难以保证。GC含量尽可能在50%～60%。这一点在扩增某些物种（如放线菌）基因组时同样难以保证。高GC模板扩增需要加入一些特殊成分来优化实验，目前也有商品化的试剂。
因此大量有关qPCR发表的文献中存在结果证据不足甚至是相互矛盾的结果，这对科学研究是一个很大的危险。科学文献的发表和撤回也为人们提出了警示。多数研究报告缺少足够的信息加剧了这个问题，使用qPCR的文献没有提供足够的实验细节，可以让读者评估结果的质量或者重复实验。具体表现为样本的采集和处理信息，RNA质量和完整性，反向转录细节，PCR效率，以及分析参数等等，这些信息常常被忽略，然而样本正规化是反对没有价值的单一参考基因。qPCR的好处有些什么？
qPCR是不是会做不好呢？即使是看了人家文献里的PCR方法，照搬了人家的引物，还是做得每次结果都不一样？其实具体原因有这么几个。首先，你基本上不太会用移液头。移液头特别是微量移液头，特别长期快速操作，也就是说弹簧没来得及恢复又进行下一步按压。极其容易导致……你的大拇指关节受损。好吧，这都是其次，关键是你的移液量可能都会有变化。所以，关爱拇指，吸取液体时，保持1-2秒，给弹簧一个缓冲。当然，在加模板的时候，提高模板加样量，也可以尽可能减少每次加样的误差。吸取液体的时候，需要把头插入凹液面底部，而不是插到凹液面的侧面。侧面比较容易产生气泡：当然，你会说，每次头都插很深，但是这样的话，就很容易在头上沾上液滴，在微量的模板加样时，很容易导致加样量的误差。TaqMan荧光探针qPCR公司哪家靠谱？辽宁qPCR机构电话
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负对照有信号引物设计不够优化：应避免引物二聚体和发夹结构的出现。引物浓度不佳：适当降低引物的浓度，并注意上下游引物的浓度配比。镁离子浓度过高：适当降低镁离子浓度，或选择更合适的mix试剂盒。模板有基因组的污染：RNA提取过程中避免基因组DNA的引入，或通过引物设计避免非特异扩增。扩增效率低反应试剂中部分成分特别是荧光染料降解。反应条件不够优化：可适当降低退火温度或改为三步扩增法。反应体系中有PCR反应抑制物：一般是加入模板时所引入，应先把模板适度稀释，再加入反应体系中，减少抑制物的影响。河南相对定量qPCR哪里有
