什么是CT值比较法？数据怎么处理？CT值与起始DNA浓度的对数成反比：如果：不同管之间的PCR反应效率相同。这些PCR的反应效率接近100%。可以从上面的公式推出相对含量（X01/X02）=2-ΔCT。假设实验的目标是研究药物处理后0、24、48小时IL-2基因在某种组织中的表达量的变化，所用内对照是18SRNA基因。IL-2和18SRNA的测定结果都是CT值，而没有通过标准曲线测定总RNA的pg数。内标法和外标法哪种数据更精密？是同样可靠的。内标的优点在于目标基因与管家基因的反应条件较接近一致，缺点在于目标基因与管家基因的引物和探针相互之间会发生竞争与抑制，导致它们的PCR效率有差异。外标的优点在于目标基因与管家基因的引物和探针之间没有发生竞争与抑制的机会，但是不同管之间的反应条件差异比同管的要大，也会导致它们的PCR效率有差异。两相比较，内标法与外标法的数据精确度是一样的。上海融享生物科技有限公司实时荧光定量qPCR服务。上海SYBRGreen法qPCR
引物用于启始PCR反应，其质量直接关乎实验成败。引物设计一般遵循以下原则：长度在15～30bp（一般为18～25bp），GC含量尽可能在50%～60%。严重的比例失衡会导致引物二聚体增多。Tm值在50℃～65℃。过高会导致扩增受影响（DNA聚合酶有一定的工作温度范围）；过低容易产生错配，特异性差。目前很多软件和网站可以预测引物的Tm值，要注意的是该值（包括引物合成单中的Tm）只只是预测，并不表示实际情况，PCR时比较好的退火温度需要通过温度梯度实验来得到。避免匹配模板的二级结构区域。避免连续出现三个以上G或者C碱基。引物中碱基分布比较好是随机的，否则可能会在基因组中的GC密集区发生错误匹配。3’端尽量安置G或者C碱基。GC配对的强氢键作用对于启始PCR反应具有更好的作用。避免引物二聚体的出现。其中包括自身配对和上下游引物配对，这要求3’端序列尽可能不要出现大量碱基配对。 河南实时荧光定量qPCR电话选择一款靠谱的产品，一次性把 qPCR 做好，把更多的精力投入到科研思路、科研创造中，才能更快产生科研价值。
即使操作如此简单，很多实验者仍然会轻视。在此建议，将温度梯度优化纳入到预实验环节中，通过qPCR的温度梯度方法确认比较好的Ta值。还要提醒大家，软件预测的引物和探针的Ta值只用于参考，而且比较好Ta值会随着反应环境的变化而变化，预测的准确度并没有预期的那么高，因此不能盲目迷信，比较好的Ta值仍然要通过实验证据来确认。扩增子、探针和引物：说完退火温度，再来聊聊扩增子的选取、探针和引物的设计，这也是扩增效率的重要影响因素。
1.每个qPCR试剂盒在上市前应该按照行业统一的标准进行各种指标的系统评估，试剂盒生产厂家应该提供这些参数供客户进行选择和验证。检测实验室也应该具备对试剂盒进行性能验证的能力。2.一个qPCR试剂盒的重要是引物探针设计、酶、反应体系和比较好的反应条件，试剂盒生产厂家应该从根本上去改进自己的试剂盒而不是做一些文字游戏。3.对于检测来说，qPCR试剂盒只是其中的一个环节，如果想得到可靠的检测结果还需要对采样、运输、保存、处理、提取和扩增的每个环节进行质量控制（检测全流程质量控制）。实验室的检测人员也不要抱有解决了qPCR试剂盒的问题就解决了检测中所有问题的幻想。做 qPCR,不要钻进唯Ct值的牛角尖。
qPCR做不好的原因:RNA的降解，当然也就是RNA完整性的问题，RNA的完整性，一般体现在电泳过程中18S和28S的亮度上，如果这两个条带的RNA亮度变低，甚至没有，就说明RNA的完整性应该会有损失。导致RNA完整性受损的原因有很多，比如：包括镁离子，pH，温度，紫外线，福尔马林等等都会对你的RNA产生影响。所以，要处处小心。于是有人做了这样的实验，就是对于RNA的降解，有没有什么方法可以降低RNA降解对于qPCR的影响。他们分别分析了3`端和5`端的扩增CT值，以及长片段和短片段的ΔCT，发现RNA的完整性缺失与3`端和5`端没多大关系，但是短片段会比长片段扩增效率更高。所以，qPCR引物设计的过程中，尽量把片段设计得短一点。上海qPCR机构哪里有？江西SYBRGreen法qPCR机构
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