（1）ABC复合物的制备：（2）ABC法反应原理6．SP或SAP法（过氧化物酶标记的链霉卵白素或过氧化物酶标记的碱性磷酸酶染色）Streptavidin/peroxidaseorstrepta-vidin/alkalinephosphatase）※该法是ABC法基础上的进一步改良，使卵白素与链霉（而非生物素）结合，而后再结合PO。它有4个亚基可与生物素结合，灵敏特异，背景低，成本低。现在还有plus盒。优点是：更简便，放大倍数↑，等电点中性更适合组织。分子量小，穿透力↑。7．蛋白A—金法（Protein—Agoldmethod）~多用于电镜8．双重组化染色法应用双重免疫组织化学可在同一张切片，同一细胞或亚细胞结构内同时显示两种不同的抗原。9．免疫金—银染色法（Immunogold—silverstainingIGSS）固定——见前述注意事项：1．固定剂的选择：因组织而不同，注意质量和性能。2．固定方式的选择：①浸渍固定（参考文献）②灌注固定（+后固定）③蒸汽固定免疫组化染色步骤（以ABC法为例）1．切片脱蜡入水，入PBS洗三次/15分钟。2．封闭内源性过氧化物酶。用新配置的（在PAS或—HCL缓冲液）室温，30分钟。3．水洗，入PBS，洗三次，每次5分钟。4．减少非特异性着色用稀释20倍的正常血清（产生二次抗体动物血清！），室温，30分钟。专业从事免疫实验的整体方案。北京免疫组化机构哪家好
冰冻切片是借助低温冷冻将活检组织快速冻结达到一定的硬度进行制片的一种方法，手术中等待冰冻快速病理报告，以病变性质而决定手术方式和范围。而及时、准确的发出报告需要高质量的冰冻切片，鉴于冰冻切片常出现染色模糊不清的现象，对病理判断造成困难，甚至造成误诊或漏诊，实践中我们发现和组织固定、染色时返蓝有一定关系，为了提高冰冻制片质量，我们将FAA、Bouin氏液、88酒精三种固定液作了比较，并在染色中加用促蓝液，认为用88酒精固定液及染色时加用促蓝液制作的冰冻切片质量较理想，吉林免疫组化机构哪里有免疫组化检测服务找融享生物。
减少或消除非特异性染色的方法 组织中非抗原抗体反应出现的阳性染色称为非特异性背景染色，较好常见的原因是蛋白吸附于高电荷的胶元和结缔组织成分上。有效方法是在用首先抗体前加制备第二抗体动物之非免疫血清（1：5-1：20）封闭组织上带电荷基团而除去与首先抗体非特异性结合。必要时可加入2%-5%牛血清白蛋白，可进一步减少非特异性染色。作用时间为10-20min。也可用除制备首先抗体以外的其它动物血清（非免疫的）。有明显溶血的血清不能用，以免产生非特异性染色。免疫荧光染色时，可用0.01%伊文氏兰(PBS溶液)稀释荧光抗体,对消除背景的非特异性荧光染色有很好的效果。当然使用特异性高、效价高的首先抗体是较好重要的条件。洗涤用的缓冲液中加入0.85%~1%NaCl成为高盐溶液,充分洗涤切片,能有效的减少非特异性结合而减少背景染色。
标本
实验所用主要为组织标本和细胞标本两大类，前者包括石蜡切片（病理切片和组织芯片）和冰冻切片，后者包括组织印片、细胞爬片和细胞涂片。
其中石蜡切片是制作组织标本比较好常用、比较好基本的方法，对于组织形态保存好，且能作连续切片，有利于各种染色对照观察；还能长期存档，供回顾性研究；石蜡切片制作过程对组织内抗原暴露有一定的影响，但可进行抗原修复，是免疫组化中优先的组织标本制作方法。抗体
免疫组化实验中常用的抗体为单克隆抗体和多克隆抗体，单克隆抗体是一个B淋巴细胞克隆分泌的抗体，应用细胞融合杂交瘤技术免疫动物制备。多克隆抗体是将纯化后的抗原直接免疫动物后，从动物血中所获得的免疫血清，是多个B淋巴细胞克隆所产生的抗体混合物。
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免疫组化镜检
在镜检前可以通过相关资料查询抗体的表达部位：细胞间质、细胞膜、细胞浆、核膜、细胞核以及在其中的多个部位表达（如：MPO抗体表达在细胞膜、细胞浆、核膜、细胞核上）和表达组织（如：VWF抗体在血管壁上表达，呈现环形）。
在显微镜下观察时，先在4倍镜下查找组织及其范围，然后查看整个组织确定阳性产物的表达部位，然后将阳性产物表达部位置于视野正**，换高倍镜观察。细胞凋亡检测
细胞凋亡原理：正常凋亡细胞通过检测凋亡细胞段进行染色，正常的、人为造成凋亡的细胞很少能够被染色。以甲基绿复染，便于从形态学上分辨评估正常细胞和凋亡细胞。
首先确定目标凋亡细胞的组织部位（如眼球组织，由于玻璃体结构内没有细胞核，因此看不到凋亡，在整个组织的较好外面有单层视网膜细胞，因此只能在较好边缘查看凋亡细胞的阳性产物）
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这些常用免疫组织化学方法的原理如下：
1. 免疫荧光细胞化学技术
将已知抗体标上荧光素,以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原,在荧光显微镜下观察.当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后会发出一定波长的荧光,从而可以确定组织中的抗原定位或定量.
2. 免疫酶细胞化学技术
是免疫组织化学研究中较好常用的技术．基本原理是先以酶标记的抗体与组织或细胞作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，通过光镜或电镜，对细胞或组织内的相应抗原进行定位或定性研究．
3. 免疫胶体金技术
就是用胶体金标记一抗，二抗或其他的能特异性的结合免疫球蛋白的分子（如葡萄球菌A蛋白）等作为探针对组织或细胞内的抗原进行定性，定位或定量研究．由于胶体金的电子密度高，多用于免疫电镜的单标记或多标记的定位研究
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