云南重现性数字PCR服务

数字PCR可以直接计算目标序列的拷贝数，因此无需依赖于对照样品和标准曲线就可以进行精确的***定量检测；此外，由于数字PCR在进行结果判读时*判断有/无两种扩增状态，因此也不需要检测荧光信号与设定阈值线的交点，完全不依赖于Ct值的鉴定，因此数字PCR的反应受扩增效率的影响**降低，对PCR反应抑制物的耐受能力**提高；数字PCR实验中标准反应体系分配的过程可以极大程度上降低与目标序列有竞争性作用的背景序列浓度，因此数字PCR技术也特别适合在复杂背景中检测稀有突变。线粒体拷贝数分析与线粒体突变分析。云南重现性数字PCR服务

尽管dPCR被称作第三代PCR技术，但dPCR技术的广泛应用逐渐显现出一些不足之处。通量不高、操作复杂，同时成本**增加，dPCR似乎还没有找到相对qPCR足够的不可取代性优势。另一方面，dPCR增加了很多技术难点，如何制作成本低廉的芯片，如何集成液滴生成和PCR扩增，如何进行灵敏的信号检测和分析，如何提高自动化程度，实现Sample-In Result-Out。相较于Digital ELISA能够提高免疫检测的灵敏度到fg/mL级别，实现了高敏蛋白的检测，dPCR尽管发展更早，却难以取得Killer Application，或许这也导致了所谓的第三代PCR在很多人看来却没那么“下一代”。山东高精确度数字PCR售后分析良好的引物探针设计是数字PCR实验获得成功的关键因素之一。

微流控芯片技术的发展为我们提供了一个实现低成本、小体积和高通量平行PCR分析的理想平台。2000年，Unger等采用多层软刻蚀 ( multilayer soft lithography，MSL) 技术在聚二甲基硅氧烷( polydimethylsiloxane，PDMS) 微流控芯片上设计并加工高密度微泵微阀结构(如图2b所示) ，他们将这种芯片称为IFC( integrated fluidic circuit)。IFC 利用PDMS材料具有高弹性的特点，通过多层软刻蚀技术在芯片上加工交织的液体和气体通道结构，可以快速并准确地将流体分成若干个**的单元，进行多步平行反应。2006 年Ottesen等将IFC芯片用于数字PCR分析，通过精细控制微泵微阀的开启和关闭，一步操作即可将一个样本平均分配到 1176个反应单元中，每个反应单元的体积只有6. 25 nl，成功代替了传统点样仪和384孔板。他们同时进行了6个样本7 056个单元的平行数字PCR分析。此外， Hansen及其同事采用 MSL技术加工了具有10^6个结构单元的数字PCR 芯片，每个反应单元的体积降低至10 pl，芯片密度达到 440000 /cm2。与微反应室数字PCR系统相比，IFC的特点是通量更高，每个反应单元的体积更小，加样更快。**近，Men等在2mm×2mm区域内加工了82000个 fl 级反应单元，进行数字PCR分析。

该技术提出至今虽然只有十几年时间，但是由于其独特的技术优势和应用前景，使得其产业化发展相当迅速。迄今为止，已有包括Fluidigm和 Bio-Rad等几家公司相继推出了数字 PCR 产品，并已经应用于单细胞分析、**早期诊断和产前诊断等研究领域。目前，有关数字 PCR 技术的综述类文献并不多见，本文将在现有文献基础上，对该技术的原理、定量方法、分类及应用进行评述，并对发展趋势进行展望。数字 PCR 技术提出至今，相关技术和产业化发展都非常迅速。迄今为止，数字 PCR 技术主要有三类: 微反应室/孔板、大规模集成微流控芯片和液滴数字PCR系统。原始数据中往往发现阳性信号与阴性背景之间存在许多弱阳性信号。

数字PCR的技术优势在SARS-CoV-2的核酸检测中得到了完整的体现，在低拷贝病毒样本检测、不同临床样本类型病毒载量定量、样本制备方法评估、病情进展动态监测、参考品制备、环境中病毒浓度监测、病毒突变检测和抗病毒药物评价多个方面均有重要作用：（1）在低拷贝病毒样本检测中，数字PCR相比COVID-19诊断金标准逆转录荧光定量PCR（RT-qPCR）具有更低的检测限和更高的灵敏度。（2）针对不同类型的COVID-19临床样本（如鼻咽拭子、痰液、血液、尿液、粪便、支气管肺泡灌洗液等），使用数字PCR能够有效评估各个类型样本的病毒载量，尽可能选择病毒载量**多的样本以提高检出率。（3）在样本制备方法评估中，利用数字PCR定量不同灭活方法处理前后样本中的病毒量，能够明确处理方法对样本的影响，从而为临床实验室提示比较好样本制备方法。（4）研究人员利用数字PCR定量患者不同时期的样本中的病毒载量，发现在早期和进展期的病毒载量明显高于恢复期的病毒载量，提示动态监测样本中的病毒载量有助于评估疾病的进展。增加引物或探针的Tm值，从而实现更短的引物和探针设计。云南数字PCR数字PCR方案

通过直接计数或泊松分布公式计算得到样品的原始浓度或含量。云南重现性数字PCR服务

QuantaLife 利用油包水微滴生成技术 开发了微滴式数字PCR技术，这也是**早出现的相对成熟的数字PCR平台，在运行成本和实验结果稳定性方面都基本达到了商品化的标准。2011年，QuantaLife 公司被Bio-Rad公司收购，其微滴式数字PCR仪产品更名为QX100型号仪继续在市场上销售，这个早期型号为dPCR概念的普及和应用领域的拓展发挥了重要作用。2013年该公司又推出了升级型号QX200。2012年，RainDance公司推出Raindrop型号数字PCR设备，这个设备将其原有的二代测序文库制备平台技术平移到数字PCR技术平台，在高压气体驱动下，将每个标准反应体系分割成包含100万至1000万个皮升级别微滴的反应乳液， 该公司的创始人之一Darren Link表示这种超高的微滴数目可以为用户“提供更高的检测动态范围，适用于处理更大浓度差异的不同样品”。云南重现性数字PCR服务