北京高灵敏度数字PCR口碑推荐

与传统qPCR技术相比，数字PCR技术具有极高的灵敏度、特异性和精确性，但截止目前而言，数字PCR对广大科研工作者仍然是一种全新的检测方法，我们在看待数字PCR的应用前景时，更应该保持一种开放的心态，与其说数字PCR技术是一个新的检测平台，不如把它视为一种全新的技术思路和手段，在这个平台上必将有更多的应用帮助我们深入到分子生物学研究的更高层次。数字PCR被称为第三代PCR技术，相比于传统的PCR技术和荧光定量PCR技术，其具有诸多优势：（1）***定量，不依赖标准品和参考曲线，定量结果更加准确可靠；（2）高灵敏度，可实现单分子级检测；（3）高分辨率，适合在大量背景模板的干扰下对罕见的目标分子进行检测；（4）高稳定性，对抑制剂的耐受程度**增强。凭借这些优势，数字PCR被广泛应用于多个不同的领域[4]，特别是生物医学领域，包括稀有突变检测、基因拷贝数变异检测、基因表达研究、甲基化水平检测、**液体活检、无创产前检测、微生物（病毒、细菌等）检测、移植排斥监控和二代测序辅助建库等。此外，此技术也被用于农业、食品安全和环境科学等诸多领域。常见的300种人、小鼠和大鼠基因表达Assay均已在QIAcuity数字PCR平台上经过验证。北京高灵敏度数字PCR口碑推荐

数字PCR技术的原理非常简单，然而在样品分散（divide）的环节上却遇到了无法突破的瓶颈。早期的dPCR尝试使用96孔板到384孔板甚至1536孔板作为分散反应的载体，或者采用类似流式技术的磁珠乳液扩增方法(BEAMing-Beads, Emulsion, Amplification, Magnetics)，2006年 Fluidigm公司推出了***台商品化的基于芯片的商品化数字PCR系统。2008年德国 Inostics 推出基于磁珠法乳浊液扩增和流式检测方式的BEAMing dPCR 检测服务，但这些方法无论在分散程度和数据群体的体量上都无法达到更加精细的要求，时间和耗材成本严重限制了dPCR技术的发展。上海荧光信号数字PCR提取外泌体也是个非常费时费钱的事情。

为确保实验顺利进行，QIAcuity EG PCR Kit和Probe PCR Kit均采用**抗体修饰的热启动DNA聚合酶，利用小分子锁扣 (Guard molecular) 将DNA聚合酶与抗体紧密结合形成双保险，使其室温条件下失活，只有通过95℃高温2分钟才能开启小分子锁扣，***DNA聚合酶活性，有效避免了非特异性扩增现象。微反应单元体积大小一致且稳定是泊松分布准确计算的前提。样本反应液在进行液滴分散过程中由于液体表面张力、操作不当等影响，导致其部分发生融合和破裂。融合使液滴体积变大，破裂则导致有效分区数量变少更增加了交叉污染的风险。因此，整个实验过程需严格按照标准流程进行实验操作。相较于液滴式分区，QIAcuity数字PCR搭配的Nanoplate采用**纳米微孔设计，利用微流体技术将数字PCR反应体系分配到大小均一且固定微孔中，并在分区完成后自动封闭所有微孔联通管道，真正意义上实现**均一的微反应体系。

数字PCR的发展方向包括：（1）提高检测通量，可对多个靶标多个标本并行检测；（2）开发多靶点检测的多重数字PCR检测，可以通过多种荧光染料或标记技术来实现；（3）提高检测自动化程度，实现一键式检测的自动化检测流程；（4）提高检测速度，进一步降低检测时间；（5）提高检测动态范围；（6）降低检测成本。数字PCR仪的技术先进性已经有共识，作为一种全新的思路和手段，临床一直对其抱有很大的期待，是未来临床分子诊断的关键平台。要做到这一点，需要更好的满足临床需求，比如多指标、通量高、自动化、稳定性好、防污染、成本低。好的产品都是在使用中成长起来的，***的产品稳定性带来愉快的使用体验，这还需要时间的历练。同时，我们看到数字PCR作为**科学仪器和医疗器械，国产技术研发、合作的进步非常快，有望更快的推动数字PCR在临床中深入应用。在gDNA长度≥20kb或进行拷贝数变异检测实验时，必须对样品进行酶切处理。

微流控芯片技术的发展为我们提供了一个实现低成本、小体积和高通量平行PCR分析的理想平台。2000年，Unger等采用多层软刻蚀 ( multilayer soft lithography，MSL) 技术在聚二甲基硅氧烷( polydimethylsiloxane，PDMS) 微流控芯片上设计并加工高密度微泵微阀结构(如图2b所示) ，他们将这种芯片称为IFC( integrated fluidic circuit)。IFC 利用PDMS材料具有高弹性的特点，通过多层软刻蚀技术在芯片上加工交织的液体和气体通道结构，可以快速并准确地将流体分成若干个**的单元，进行多步平行反应。2006 年Ottesen等将IFC芯片用于数字PCR分析，通过精细控制微泵微阀的开启和关闭，一步操作即可将一个样本平均分配到 1176个反应单元中，每个反应单元的体积只有6. 25 nl，成功代替了传统点样仪和384孔板。他们同时进行了6个样本7 056个单元的平行数字PCR分析。此外， Hansen及其同事采用 MSL技术加工了具有10^6个结构单元的数字PCR 芯片，每个反应单元的体积降低至10 pl，芯片密度达到 440000 /cm2。与微反应室数字PCR系统相比，IFC的特点是通量更高，每个反应单元的体积更小，加样更快。**近，Men等在2mm×2mm区域内加工了82000个 fl 级反应单元，进行数字PCR分析。原始数据中往往发现阳性信号与阴性背景之间存在许多弱阳性信号。北京高灵敏度数字PCR口碑推荐

数字PCR分区方法主要包括3种：微流体数字PCR、微滴数字PCR和芯片数字PCR。北京高灵敏度数字PCR口碑推荐

数字PCR可以直接计算目标序列的拷贝数，因此无需依赖于对照样品和标准曲线就可以进行精确的***定量检测；此外，由于数字PCR在进行结果判读时*判断有/无两种扩增状态，因此也不需要检测荧光信号与设定阈值线的交点，完全不依赖于Ct值的鉴定，因此数字PCR的反应受扩增效率的影响**降低，对PCR反应抑制物的耐受能力**提高；数字PCR实验中标准反应体系分配的过程可以极大程度上降低与目标序列有竞争性作用的背景序列浓度，因此数字PCR技术也特别适合在复杂背景中检测稀有突变。北京高灵敏度数字PCR口碑推荐