与传统的单光子宽视野荧光显微镜相比，多光子显微镜（MPM）具有光学切片和深层成像等功能，这两个优势极大地促进了研究者们对于完整大脑深处神经的了解与认识。2019年，JeromeLecoq等人从大脑深处的神经元成像、大量神经元成像、高速神经元成像这三个方面论述了相关的MPM技术[1]。想要将神经元活动与复杂行为联系起来，通常需要对大脑皮质深层的神经元进行成像，这就要求MPM具有深层成像的能力。激发和发射光会被生物组织高度散射和吸收是限制MPM成像深度的主要因素，虽然可以通过增加激光强度来解决散射问题，但这会带来其他问题，例如烧坏样品、离焦和近表面荧光激发。增加MPM成像深度比较好的方法是用更长的波长作为激发光。利用多光子显微镜的光遗传学操作能力，我们可以对某类神经元的ji活和失活进行高精度的操作。多光子显微镜配置
对于双光子（2P）成像而言，离焦和近表面荧光激发是两个比较大的深度限制因素，而对于三光子（3P）成像这两个问题大大减小，但是三光子成像由于荧光团的吸收截面比2P要小得多，所以需要更高数量级的脉冲能量才能获得与2P激发的相同强度的荧光信号。功能性3P显微镜比结构性3P显微镜的要求更高，它需要更快速的扫描，以便及时采样神经元活动；需要更高的脉冲能量，以便在每个像素停留时间内收集足够的信号。复杂的行为通常涉及到大型的大脑神经网络，该网络既具有局部的连接又具有远程的连接。要想将神经元活动与行为联系起来，需要同时监控非常庞大且分布普遍的神经元的活动，大脑中的神经网络会在几十毫秒内处理传入的刺激，要想了解这种快速的神经元动力学，就需要MPM具备对神经元进行快速成像的能力。快速MPM方法可分为单束扫描技术和多束扫描技术。多光子显微镜配置带宽足以覆盖钛蓝宝石激光器的可调谐范围和用于多光子显微镜的许多其它激光器的典型中心频率。
ＳｔｅｒｎａｎｄＪｅａｎＭａｒｘ在评论中说：祖家能够在更为精细的层次研究树突的功能，这在以前是完全不可能的。新的技术（如脑片的膜片钳和双光子显微使人们对树突的计算和神经信号处理中的作用有了更好的理解。他们解释了是树突模式和形状多样性，及其独特的电、及其独特的电化学特征使神经元完成了一系列的专门任务。双光子与共聚焦在发育生物学中的应用双光子∶ 每2.5分钟扫描一次，观察24小时，发育到桑椹胚和胚泡阶段共聚焦∶每15分钟扫描一次，观察8小时后细胞分裂停止，不能发育到桑椹胚和胚泡阶段共聚焦激发时的细胞存活率为多光子系统的10～20%。
比较两表格中的相关参数可以看出，基于分子光学标记的成像技术已经在生物活检和基因表达规律方面展示了较大的优势。例如，正电子发射断层成像（PET）可实现对分子代谢的成像，空间分辨率∶1-2mm，时间分辨率;分钟量级。与PET比较，光学成像的应用场合更广（可测量更多的参数，请参见表1-1），且具有更高的时间分辨率（秒级），空间分辨率可达到微米。因此，二者相比，虽然光学成像在测量深度方面不及PET，但在测量参数种类与时空分辨率方面有一定优势。对于小动物（如小白鼠）研究来说，光学成像技术可以实现小动物整体成像和在体基因表达成像。例如，初步研究表明，荧光介导层析成像可达到近10cm的测量深度;基于多光子激发的显微成像技术可望实现小鼠体内基因表达的实时在体成像。利用多光子显微镜的多点光ji活能力，我们可以研究多个神经细胞之间的连接和控制。
因斯蔻浦(上海)生物科技有限公司 双光子显微镜的基本原理是：在高光子密度的情况下，荧光分子可以同时吸收 2 个长波长的光子，在经过一个很短的所谓激发态寿命的时间后，发射出一个波长较短的光子；其效果和使用一个波长为长波长一半的光子去激发荧光分子是相同的。双光子激发需要很高的光子密度，为了不损伤细胞，双光子显微镜使用高能量锁模脉冲激光器。这种激光器发出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，其脉冲宽度只有 100 飞秒，而其周期可以达到 80至100兆赫兹。在使用高数值孔径的物镜将脉冲激光的光子聚焦时，物镜的焦点处的光子密度是比较高的，双光子激发只发生在物镜的焦点上，所以双光子显微镜不需要共聚焦***，提高了荧光检测效率。世界多光子激光扫描显微镜产业主要布局在德国和日本，德国是徕卡显微系统和蔡司。美国啮齿类多光子显微镜作用
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以往我们认识的光电效应是单光子光电效应，即一个电子在极短时间内能吸收到一个光子而从金属表面逸出。强激光的出现丰富了人们对于光电效应的认识，用强激光照射金属，由于其光子密度极大，一个电子在短时间吸收多个光子成为可能，从而形成多光子电效应，这已被实验证实。为什么一般讨论的光电效应都是指单光子光电效应呢？这是因为，在使用普通光源的情况下，电子吸收两个以上光子能量的概率是非常非常小的，几乎为零。事实上，爱因斯坦本人就考虑过在强光下发生光电效应的可能性问题。对此，他有如下的论述：光电效应中的一个电子吸收两个光子的几率不会大于下雨天两个雨滴同事打在一个蚂蚁上的几率。因此，多光子光电效应在实验上的研究成为可能，是二十世纪六十年代激光乃至强激光出现以后的事情。有了激光，对于双光子光电效应，在实验上和理论上均取得了许多成果。利用强激光，人们不仅观察到双光子和三光子的光电效应，甚至观察到金靶材吸收几十个等效光子实验现象。多光子显微镜配置
