创新性的解决方案:芯弃疾JX-8B数字ELISA应用范围:各种高灵敏多重免疫检测,可替代各种ELISA试剂盒,及其他免疫检测产品。循环血液转化为~2×10−15M(或2飞摩尔,fM);早期HIV传染血清中每mL含有10-3000个病毒颗粒,相当于p24抗原浓度范围为从50×10−18M(50attomolar,aM)到15×10−15M(15fM)10.尝试开发能够测量这些蛋白质浓度的方法集中在蛋白质上的核酸标记复制,11,12或测量整体、结合标记蛋白分子的性质13-16。Mirkin等人12,17及其他研究者18使用基于金纳米颗粒和DNA生物条形码的标记物,已将蛋白质的检测范围扩展至低飞摩尔水平;更近使用该技术的一篇报道展示了检测到10飞摩尔PSA插入物17。这些方法所达到的灵敏度然而,检测蛋白质仍然落后于核酸,如聚合酶链反应(PCR),从而限制了蛋白质组中具有已在血液中检测到6,19。单个蛋白质分子的分离和检测为测量极低浓度的蛋白质s1,2提供了一种有希望的方法。 数字化高敏ELISA芯片,可以进行8孔、4孔的灵活检测。创新性数字ELISA极速检测
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每个生物实验室都用得起的单分子免疫检测
单分子酶检测到的比较低酶分子数假设蛋白质检测分析的更终灵敏度为背景信号可能由非特异性相互作用产生。为了评估内在敏感性,我们通过将400,000个带有生物素的珠子与不同浓度的酶缀合物链霉亲和素-阝-半乳糖苷酶(S阝G)混合,创建了具有明确酶与珠子比例的珠子群体。为了方便起见,生物素化珠子是通过将生物素化DNA与功能化的珠子杂交提供的。互补DNA。[我们注意到,该实验不应被视为敏感的DNA检测;该检测的敏感性受到非特异性相互作用的限制,如补充图2所示,这些相互作用发生在酶缀合物和表面结合的DNA之间。 单分子蛋白数字ELISA购买灵活芯弃疾JX-8B单分子小型化ELISA检测产品,每个实验室都能用的单分子检测;
芯弃疾JX-8B数字ELISA产品每个生物实验室都用得起的单分子免疫检测我们的方法利用了亚飞克尔反应室阵列(图1C)我们称之为单分子阵列(SiMoA)——可以分离和检测单个酶分子20-24。这种方法借鉴了Walt等人20-23的工作阵列用于研究单个酶的动力学和抑制作用。我们的目标是利用捕获和检测单个酶的能力来检测用酶标记的单个蛋白质分子。在这个单分子免疫测定的第一步(图1A),在微球(直径μm)上形成一个三明治抗体复合物,结合的复合物用酶标记,如同常规的基于微球的ELISA。当测定含有极低浓度蛋白质的样品,蛋白质的比值分子(以及由此产生的酶标记复合物)与微球的比例很小(通常小于1:1),因此含有标记免疫复合物的微球百分比遵循泊松分布,导致单个微球上存在单一免疫复合物。例如,如果在(3000个分子)的蛋白质中捕获并标记了50μM的蛋白质,并且在200,000个微球上进行标记,则珠子,然后,。无法检测到这些低数量的酶使用标准检测技术(例如,平板阅读器)的标签,因为荧光染料由每种酶生成的产物扩散到一个大卵试验体积(通常为),并进入其中需要数十万种酶标签才能产生高于该水平的荧光信号背景。
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人类形式的蛋白质被加入到25%牛血清中以代替临床测试样本;通常使用四倍稀释因子以减少免疫测定中的基质效应4。使用数字ELISA检测25%血清中的PSA,从该实验中确定了LOD为~50aM(1.5fg/mL),相当于整个血清中的LOD为~200aM(6fg/mL)。检测到的比较低浓度为250aM,相当于25%血清中的1fMin全血清。由于LOD是通过外推背景浓度来确定的加上背景的三个标准差,不同运行的LOD取决于背景的CV。在具有典型背景方差的几个实验中,全血清PSA的亚飞摩尔LOD得以保持。相比之下,一种前列的商业PSA检测方法(ADVIACentaur,西门子)报告在人血清中的LOD为3pM(0.1ng/mL),并且已经报道了LOD在10-30fM17,26。 芯弃疾JX-8B简易版单分子ELISA检测产品, 极速检测,快至15min能完成 的ELISA检测!
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由于活性珠子的百分比接近50%(酶与微球的比例大于~1:1.5),然而,使用图像分析软件区分“开启”和“关闭”孔变得具有挑战性,我们达到了数字动态范围的实际上限。例如,图2中7fM(~45%活性)的信号偏离了线性。因此,这里使用50,000个孔展示的数字线性动态范围是从3.5fM到350zM,即大约四个对数单位。前提是蛋白质使用适当的酶浓度进行标记,这种动态范围对于许多临床应用来说是足够的 芯弃疾JX-8B数字ELISA,人人都用能得起的单分子检测;飞克级数字ELISA使用速度
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从TNF-α数字ELISA测定的检测限为~150aM(2.5fg/mL),相当于全血中的~600aM(10fg/mL);市场上可用的ELISA对TNF-α的比较高灵敏度在血清中的LOD为21fM(0.34pg/mL)(补充图3)。两种方法的目标蛋白零浓度尖峰均为为这些实验提供有用的阴性对照:25%的血清含有多种蛋白质的微摩尔浓度,在这些高蛋白质背景之上可以检测到非常低浓度的目标蛋白。我们还开发了一个证明用于显示低浓度核酸可以检测到的DNA的主要数字分析方法,而无需复制目标
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