实时荧光定量 PCR(real-time quantitative
polymerase chain reaction，real-time Q-PCR)技术于
1996 年由美国 Applied Biosystems 公司推出，由于该
技术不仅实现了 PCR 从定性到定量的飞跃，而且与常
规 PCR 相比，它具有特异性更强、灵敏度高、重复性
好、定量准确、自动化程度高、全封闭反应等优点成为
分子生物学研究中的重要工具，目前已得到多应用[1]。
实时荧光定量 PCR 的应用范围非常多，包括 mRNA
表达的研究、DNA 拷贝数的检测、单核苷酸多态性的测
定等[2]。它能对结核分枝杆菌、乙型、丙型肝炎、爱滋
病、淋球菌、沙眼衣原体等病原体进行准确的定量
检测。其定量范围极宽，无需做梯度稀释，特异性更强，
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双杂交探针也是 TaqM an 探针的衍 生形式,是由 Roche 公司开发的一种 PCR 定量技术 (LightCy cler(r)实时荧光定量 PCR 系统)。该技术 的特点是将荧光基团和淬灭基团分别标记在发光探 针的 5' 端和淬灭探针的 3' 端两个不同探针上 ,两探 针可与模板同一条链相邻的序列杂交, 杂交时两探 针的荧光基团和淬灭基团便紧密相邻(1 ～ 5 bp), 从 而发生 FRET 使荧光淬灭, 荧光淬灭的程度与起始 模板的量成反比, 以此可以进行 PCR 定量分析 (Hardegg er 等 , 2000)。该方法的特点是淬灭效率 高,但由于 2 个探针结合在模板上 ,从而影响到扩增 效率;另外 ,由于需要合成 2 个较长的探针, 合成成 本相对较高。湖北TaqMan探针法qPCR机构电话qPCR的好处您了解多少呢？
在荧光定量 PCR 技术中，有一个很重要的概念—
—Ct 值。C 表示 Cycle（循环），t 表示 threshold(阈值)，
Ct 值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域
值时所经历的循环数，
荧光域值(threshold)的设定：PCR 反应的前 15 个
循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设
置是 3~15 个循环的荧光信号标准偏差的 10 倍，即：
threshold = 10 ’SDcycle 6-15。
Ct 值与起始模板的关系：研究表明，每个模板的
Ct 值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始
拷贝数越多，Ct 值越小[5-6]。利用已知起始拷贝数的标
准品可做出标准曲线，其中横坐标表示起始拷贝数的对
数，纵坐标表示 Ct 值。因此，只要获得未知样品的 Ct
值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数
耐药基因表达的研究：目前研究中发现主要的
耐药机制有：ATP结合盒基因超家族的膜转运蛋白介导
的耐药，这些蛋白包括：MDR-1基因编码的P-糖蛋白，
多药耐药相关蛋白，肺耐药相关蛋白，乳腺耐药蛋
白等；酶介导的耐药，包括拓扑导构酶，谷胱甘肽及谷
胱甘肽-S-转移酶，蛋白激酶C，脱氧胞嘧啶核苷激酶等，
凋亡基因介导的耐药，如bcl-2家族，p53基因，c-myc
等。多药耐药是多因素，多种机制共同作用的结果。
real-time反转录 PCR是了解耐药指导临床策
略的有用手段，它能观测用药前后及复发时细胞的
耐药基因mRNA表达变化，从而及时调整方案和评
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相对定量可用于对 2 个样本作为比较组中的基因表达水平进 行比较，确定处理因素施加后基因表达水平的改变。 进行相对定量时，对样本中特定 mRNA 的检测是建立 在参比样本基础上的，将定量测定结果表示为靶 mRNA/参比样本 mRNA 的比值。在假定靶序列和管家基因两者的扩增效率相同 时，可以采用比较阈值法( 2 － ΔΔCt法) 进行相对定量［11］。 该法可以直接得到目的基因相对于管家基因的定量，不必制作标准曲线，简便省时。按照公式 2 －ΔΔCt = 2 －［( 实验组vpr Ct－实验组***DH Ct) －( 对照组vpr Ct－对照组***DH Ct ) ］ 计算各实验组的 2 － ΔΔCt值，将对照组的 2 － ΔΔCt 值设为 1， 实验组与之相比，进行相对定量。qPCR的各种项目应用领域还是不一样的。四川实时荧光qPCR机构哪家好
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复合探针 复合探针(complex probes)法的 基本原理综合了 LightCy cler 和分子信标 2 种技术 的优点 ,还克服了他们的不足。首先合成 2 个探针, 一是荧光探针(25 bp), 5' 端接一荧光分子 ,另一为 淬灭探针(15 bp), 3' 端接一淬灭分子 , 淬灭探针能 与荧光探针 5' 端杂交 。当溶液中没有模板时, 2 种 探针特异结合,荧光探针发出的荧光被淬灭探针吸 收 ,溶液中没有荧光产生;当溶液中有模板时 ,在较 高温度下荧光探针优先与模板结合, 从而使两探针 分离 ,产生荧光。荧光强度与溶液中模板数量成正 比 ,因此可进行 PCR 定量。其优点为:①使用非荧 光淬灭剂,本底低 ;②对扩增效率影响小 ;③探针设 计 、合成 、标记、纯化方便。湖北TaqMan探针法qPCR机构电话
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