山西TaqMan荧光探针qPCR实验

荧光探针技术是根据标记基团的荧光共振能量 转 移 (fluorescence resonance energy transfer , FRET)原理而实现的。当某个荧光基团的发射光 谱与另一个荧光基团的吸收光谱重叠, 且 2 个基团 距离足够近时, 能量可以从短波长(高能量)的荧光 基团传递到长波长(低能量)的荧光基团, 相当于短 波长荧光基团释放的荧光被屏蔽, 这个过程称为 FRET 。定量原理:实时荧光定量 PCR 是在反应体系中 加入荧光基团 ,使产物的数量与检测到的荧光强度 成线性关系, 从而得出产物的扩增曲线 。理想的扩 增曲线应为 J 型,符合 2N 方程(其中N 为 PCR 的循 环次数),但实际上扩增曲线为 S 型。在 PCR 反应 早期,不能将产生荧光的水平与背景明显区别, 之后 荧光的产生进入指数期 、线性期和**终的平台期 ,因 此可以在指数期的某一点上检测 PCR 产物的量 ,并 由此推断起始模板含量 。 那么qPCR的优势都有哪些呢？山西TaqMan荧光探针qPCR实验

法也称作标准曲线法，是一种利用已知的标

准曲线来定量未知样本目的模板起始量的方法。以 5 点梯

度稀释所得的标准品为模板，经实时荧光定量 PCR 扩增，以

目的模板初始拷贝数的对数为横坐标，检测到的 CT 值为纵

坐标绘制标准曲线，得到线性回归方程，将未知样本的 CT

值带入该方程即可计算出目的模板的起始量。标准曲线的各

项指标：斜率、扩增效率（E）、相关系数（R2

）、间距均需进行

严格评价，从而确保该曲线的可用性。 江西相对定量qPCR上海融享生物科技有限公司主营项目很多，其中qPCR销很好。

RT-QPCR 是在**初的聚合酶链式反应的原

始基础上增加化学成分：荧光基团或荧光染料，

然后利用采集到的荧光信号，从而对酶促反应的

扩增情况动态地、实时地监测[1]目前，使得这项

成熟的扩增技术已经变成更新、更强大的定量检

测体系进一步研发的基础，它与衍生的相关技术

与手段现已经在很多领域占得了非常重要的地

位了。**早在 1992 年，Higuchi 等初次提出将动

态 PCR 连同封闭性荧光检测技术共同使用，以

对特定的基因数量进行定量的分析，开辟了研究

优化基本的 PCR 的新思路。

耐药基因表达的研究：目前研究中发现主要的

耐药机制有：ATP结合盒基因超家族的膜转运蛋白介导

的耐药，这些蛋白包括：MDR-1基因编码的P-糖蛋白，

多药耐药相关蛋白，肺耐药相关蛋白，乳腺耐药蛋

白等；酶介导的耐药，包括拓扑导构酶，谷胱甘肽及谷

胱甘肽-S-转移酶，蛋白激酶C，脱氧胞嘧啶核苷激酶等，

凋亡基因介导的耐药，如bcl-2家族，p53基因，c-myc

等。多药耐药是多因素，多种机制共同作用的结果。

real-time反转录 PCR是了解耐药指导临床策

略的有用手段，它能观测用药前后及复发时细胞的

耐药基因mRNA表达变化，从而及时调整方案和评

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用于实时荧光定量 PCR 的 DNA 染料有 SYBR Green I、

SYBR Gold、EvaGreeEB 与 EB。SYBR Green I 是 目 前 试 验 过

程中常用的一种，该染料结合于双链 DNA 的小沟处[11]，游

离的染料分子只发出微弱的荧光，锚定到双链 DNA 上的染

料才会发出强荧光。在 PCR 延 伸 阶 段，SYBR Green I 染 料

结 合上去，发出荧光，双链合成越多，荧光强度越强。SYBR

Green I 与 DNA 的结合具有非特异性，除了与目的片段结合

外，还能与其他非目的片段的双链 DNA 分子结合，如非特

异性扩增产物、引物二聚体。为了检测产物中是否含有非特

异或引物二聚体，在 PCR 反应结束后进行一个溶解曲线分

析，即温度从 50 ℃升高到 95 ℃，监测这一过程中荧光信号

的变化情况，用荧光信号变化的速度与温度作图，形成溶解

曲线，若未形成非特异或引物二聚体，特征峰只有 1 个，且

相同基因形成特征峰的 Tm 值相同；若有非特异或引物二

聚 体 时，就会出现特征峰之外的杂峰。由 于 染 料 法 对 双 链

DNA 的识别不具有特异性，所以试验过程中需要合理地设

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实时荧 光 定 量 PCR 的 扩 增 曲 线可 由 4 个 时 期 进 行 描

述，即基线期、指数增长期、线性增长期与平台期。在基线期

部分，强背景信号掩盖了微弱的荧光信号，故此时期无法对模

板的起始量进行分析。反应进入平台期，反应管内的 dNTP、

酶等被耗尽，反应环境已不适合 PCR 反应的进 行，此 时 的

PCR 产物不再增加，荧光信号达到水平状态，且同一模板的

多次技术重复的扩增曲线在该时期重复性差、可变性高，故

在这一时期同样不适合进行模板初始量的分析。在线性增

长期，虽然 PCR 反应仍在进行，但产物已不再呈指数形式增

加，在该时期也不适合模板初始量的分析。在指数增长期，

反应各组分（引物、dNTP、Mg+、酶）均过量，反应所需的环境

适中，聚合酶活性仍较高，该时期的扩增效率高，产物数量

以指数形式增加，且与初始模板量成线性相关。另外，在指

数增长期内，同一模板的多个技术重复具有高度的重复性，

在这一时期进行数据分析具有可靠性。 山西TaqMan荧光探针qPCR实验